劉明浩 杜奕奇 劉建強(qiáng) 高軍 吳洪玉 龔艷芳 李兆申

·論著·

MicroRNA-196a抑制序列對(duì)人胰腺癌PANC1細(xì)胞株HOXB8基因表達(dá)的影響

劉明浩 杜奕奇 劉建強(qiáng) 高軍 吳洪玉 龔艷芳 李兆申

目的觀察microRNA-196a(miR-196a)抑制序列轉(zhuǎn)染胰腺癌細(xì)胞株P(guān)ANC1后對(duì)其HOXB8基因表達(dá)的影響。方法將PANC1細(xì)胞分為對(duì)照組、miR-196a抑制序列組和siRNA對(duì)照組。采用脂質(zhì)體法將miR-196a抑制序列及對(duì)照siRNA分別轉(zhuǎn)染PANC1細(xì)胞。應(yīng)用RT-PCR和蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞miR-196a及其下游靶基因HOXB8 mRNA和蛋白的表達(dá)。結(jié)果轉(zhuǎn)染miR-196a抑制序列后，PANC1細(xì)胞miR-196a表達(dá)量較siRNA對(duì)照組顯著減少(0.050±0.054比0.839±0.025，t=3.12，P<0.05)；HOXB8 mRNA表達(dá)量較siRNA對(duì)照組增高1.57倍(2.20±0.07比1.29±0.10，t=3.86，P<0.05)；HOXB8蛋白表達(dá)量也顯著增強(qiáng)(0.90±0.03比0.40±0.10，t=3.11，P<0.05)。結(jié)論miR-196a可以下調(diào)HOXB8基因的表達(dá)。

胰腺腫瘤； 微小RNA； miR-196a； HOXB8

MicroRNAs(miRNAs)是長(zhǎng)度為18～25堿基的內(nèi)源性非編碼小分子RNA，其通過(guò)與靶mRNA3′端相結(jié)合導(dǎo)致mRNA降解或翻譯受抑制從而調(diào)節(jié)基因

的表達(dá)[1]。MicroRNA-196a(miR-196a)作為一種miRNA，可以在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)細(xì)胞基因的表達(dá)[2]。目前研究發(fā)現(xiàn)，胰腺癌miR-196a高表達(dá)提示患者預(yù)后較差[3]。我們通過(guò)Targetscan miRNA靶基因預(yù)測(cè)軟件發(fā)現(xiàn)，HOXB8與miR-196a存在高度同源序列。而HOXB8基因能特異性地調(diào)節(jié)人體的發(fā)育，其過(guò)表達(dá)與結(jié)直腸癌相關(guān)[4]。為此，本研究應(yīng)用miR-196a抑制序列轉(zhuǎn)染胰腺癌PANC1細(xì)胞，觀察轉(zhuǎn)染后細(xì)胞的HOXB8基因表達(dá)。

材料與方法

一、細(xì)胞培養(yǎng)及miR-196抑制序列轉(zhuǎn)染

PANC1胰腺癌細(xì)胞株購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)，常規(guī)培養(yǎng)、傳代。接種細(xì)胞于25 cm2培養(yǎng)瓶，分為空白對(duì)照組、miR-196a抑制序列(antagomir，GeneCopoeia)組和siRNA對(duì)照組。待細(xì)胞生長(zhǎng)至60%～70%融合時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。空白對(duì)照組培養(yǎng)液中只加lipofactamine 2000；miR-196a抑制序列組培養(yǎng)液中加lipofactamine 2000和miR-196a抑制序列(75 nmol/L)；siRNA對(duì)照組培養(yǎng)液中加lipofactamine 2000和與miR-196a不匹配的siRNA(75 nmol/L)。miR-196a抑制序列、不匹配的對(duì)照siRNA均購(gòu)自Ambion公司，lipofactamine 2000轉(zhuǎn)染試劑盒購(gòu)自Invitrogen公司，按照說(shuō)明書(shū)操作，48 h后收集細(xì)胞。

二、實(shí)時(shí)定量PCR

采用Trizol試劑(Invitrogen公司)提取各組細(xì)胞總RNA。分光光度計(jì)法測(cè)定RNA純度和濃度。miR-196a反轉(zhuǎn)錄試劑盒及PCR試劑盒均購(gòu)自Invitrogen公司。miR-196a序列為UAGGUAGUU-UCAUGUUGUUGGG(MIMAT 0000226)。在此基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)針對(duì)miR-196a的具有莖-環(huán)結(jié)構(gòu)序列：5′-GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCAATTG-CACTGGATACCCCAAC-3′。其上游及下游引物分別為GGGCTAGGTAGTTTCATGTTG及AGTGCGTGT-CGTGGAGTC。以U6作為內(nèi)參，上游及下游引物分別為CTCGCTTCGGCAGCACA及AACGCTTCA-CGAATTTGCGT。先行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，反應(yīng)條件：16℃ 30 min，42℃ 30 min，85℃ 5 min，4℃保存待分析。PCR反應(yīng)條件：95℃ 10 min，95℃ 15 s、60℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)。利用Real-time PCR儀自帶軟件獲得Ct值，通過(guò)公式2-ΔΔCt計(jì)算Relative Quantification(RQ)值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取均值。

HOXB8引物上、下游序列分別為5′-CCATAA-AGCAATTCACAGATAGAGG-3′及5′-GGTTGCGAGGAAAGATG-3′，由上海英俊生物有限公司合成。應(yīng)用SYBR Green法檢測(cè)HOXB8 mRNA，以GAPDH為內(nèi)參，試劑盒購(gòu)于Invitrogen公司。反應(yīng)條件：94℃ 5 min，94℃ 30 s、58℃或60℃ 30 s、72℃ 30 s，35個(gè)循環(huán)，最后72℃ 5 min。mRNA表達(dá)量計(jì)算方法同上，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取均值。

三、蛋白質(zhì)印跡法

提取細(xì)胞總蛋白，定量后常規(guī)行蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)HOXB8蛋白表達(dá)。鼠抗人HOXB8一抗購(gòu)自Abcam公司(Ab86610)，工作濃度1∶800；羊抗鼠IgG購(gòu)自Abcam公司，工作濃度1∶1000；DAB顯色液購(gòu)自Thermo公司。應(yīng)用BIORAD Flour-S Muilti-Imager凝膠成像儀攝片，用ImageJ 1.42q分析軟件分析條帶灰度，以目的條帶與內(nèi)參β-actin條帶灰度比值表示蛋白的表達(dá)水平。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

一、各組細(xì)胞miR-196a的表達(dá)

空白對(duì)照組、siRNA對(duì)照組、miR-196a抑制序列組細(xì)胞的miR-196a表達(dá)量分別為0.840±0.025、0.839±0.025、0.050±0.054。miR-196a抑制序列組miR-196a表達(dá)較siRNA對(duì)照組顯著下降(t=3.12，P<0.05)，而兩對(duì)照組間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，圖1)。

二、各組細(xì)胞HOXB8 mRNA的表達(dá)

空白對(duì)照組、siRNA對(duì)照組、miR-196a抑制序列組細(xì)胞的HOXB8 mRNA表達(dá)量分別為1.00±0.05、1.29±0.10、2.20±0.07。miR-196a抑制序列組的HOXB8 mRNA表達(dá)量較空白對(duì)照組增高2.2倍(t=4.45，P<0．05)，較siRNA對(duì)照組增高1.57倍(t=3.86，P<0.05)，而兩對(duì)照組間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，圖1)。

圖1 miR-196a及HOXB8 mRNA的表達(dá)

三、各組細(xì)胞HOXB8蛋白的表達(dá)

空白對(duì)照組、siRNA對(duì)照組、miR-196a抑制序列組細(xì)胞的HOXB8蛋白表達(dá)量分別為0.30±0.06、0.40±0.10、0.90±0.03。miR-196a抑制序列組HOXB8蛋白表達(dá)較其他兩組均顯著增加(t=3.34，P<0.05；t=3.11，P<0.05)，而兩對(duì)照組間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，圖2)。

圖2 HOXB8蛋白的表達(dá)

討 論

目前研究已經(jīng)證實(shí)miRNAs可能作為胰腺癌的癌基因或者抑癌基因參與其發(fā)生、發(fā)展[3]。Zhang等[5]檢測(cè)了10種胰腺癌細(xì)胞株及17例胰腺癌與配對(duì)癌旁正常胰腺組織的標(biāo)本，有7種miRNA在胰腺癌細(xì)胞株及組織中表達(dá)顯著升高，包括miR-196a、miR-190、miR-186、miR-221、miR-222、miR-200b、miR-15b。Wang等[6]報(bào)道，胰腺導(dǎo)管腺癌患者血清miR-196a水平較正常人血清miR-196a水平顯著增高。Bloomston等[3]報(bào)道，高表達(dá)miR-196a的胰腺癌患者的預(yù)后較低表達(dá)患者差。Hoffman等[7]報(bào)道， miR-196a高表達(dá)人群的乳腺癌患病率較低，提示miR-196a在乳腺癌中作為一種抑癌基因。Schimanski等[8]研究證實(shí)miR-196a在結(jié)直腸癌中表達(dá)顯著升高，并且與結(jié)直腸癌細(xì)胞的遷移、侵襲及對(duì)化療藥物的敏感性有關(guān)，但與癌細(xì)胞的增殖及凋亡無(wú)關(guān)。Maru等[9]報(bào)道，Barrett′s食管患者miR-196a表達(dá)較正常人顯著增強(qiáng)，并且證實(shí)KRT5、SPRR2C和S100A9為miR-196a的靶基因。Qiu等[10]報(bào)道，miR-196a與非洲爪蟾的眼部發(fā)育有關(guān)，預(yù)示miR-196a可能作為治療眼部疾病的新的基因靶點(diǎn)。最近的研究[11]發(fā)現(xiàn)，miR-196a在黑色素瘤細(xì)胞表達(dá)較正常的黑色素細(xì)胞低，以上報(bào)道均說(shuō)明miR-196a在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中起著重要的作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，miR-196a在胰腺癌細(xì)胞株及組織中表達(dá)顯著增強(qiáng)，表明miR-196a參與胰腺癌的發(fā)生，起著癌基因的作用。

我們通過(guò)miRNA靶基因預(yù)測(cè)軟件發(fā)現(xiàn)HOXB8可能為miRNA下游靶基因。文獻(xiàn)報(bào)道HOXB8基因與哺乳動(dòng)物胚胎發(fā)育相關(guān)，miR-196a可通過(guò)負(fù)調(diào)節(jié)HOXB8基因影響器官的發(fā)育[12]。最近報(bào)道HOXB8基因與結(jié)腸癌等腫瘤的發(fā)生、發(fā)展也存在一定相關(guān)性[13]。本研究將miR-196a抑制序列轉(zhuǎn)染PANC1細(xì)胞，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染后的PANC1細(xì)胞的HOXB8 mRNA和蛋白的表達(dá)增強(qiáng)，證實(shí)miR-196a是負(fù)調(diào)控HOXB8基因的，其調(diào)控機(jī)制需進(jìn)一步探討。

[1] Ambros V. The functions of animal microRNAs．Nature, 2004,431：350-355.

[2] Bentwich I, Avniel A, Karov Y, et al. Identification of hundreds of conserved and nonconserved human microRNAs, Nat Genet, 2005,37:766-770.

[3] Bloomston M, Frankel WL, Petrocca F, et al. MicroRNA expression patterns to differentiate chronic pancreatitis. JAMA,2007, 297:1901-1908.

[4] Kosaki K, Kosaki R, Suzuki T, et al.Complete mutation analysis panel of the 39 human HOX genes.Teratology,2002,65:50-62.

[5] Zhang Y, Li M, Wang H, et al. Profiling of 95 microRNAs in pancreatic cancer cell lines and surgical specimens by real-time PCR analysis. World J Surg, 2009, 33:698-709.

[6] Wang J, Chen J, Chang P, et al. MicroRNAs in plasma of pancreatic ductal adenocarcinoma patients as novel blood-based biomarkers of disease.Cancer Prev Res, 2009,2: 807-813.

[7] Hoffman AE, Zheng T, Yi C, et al. microRNA miR-196a-2 and breast cancer: a genetic and epigenetic association study and functional analysis. Cancer Res, 2009, 69:5970-5977.

[8] Schimanski CC,Frerichs K, Rahman F, et al. High miR-196a levels promote the oncogenic phenotype of colorectal cancer cells. World J Gastroenterol, 2009,15:2089-2096.

[9] Maru DM, Singh RR, Hannah C, et al. MicroRNA-196a is a potential marker of progression during Barrett′s metaplasia-dysplasia-invasive adenocarcinoma sequence in esophagus. Am J Pathol, 2009, 174: 1940-1948.

[10] Qiu R,Liu Y, Wu JY, et al. Misexpression of miR-196a induces eye anomaly in Xenopus laevis. Brain Res Bull, 2009, 79: 26-31.

[11] Braig S, Mueller DW, Rothhammer T, et al. MicroRNA miR-196a is a central regulator of HOX-B7 and BMP4 expression in malignant melanoma. Cell Mol Life Sci, 2010, 67: 3535-3548.

[12] Mansfield JH, Harfe BD, Nissen R, et al. MicroRNA responsive “sensor” transgenes uncover Hox-like and other developmentally regulated patterns of vertebrate microRNA expression. Nat Genet, 36:1079-1083.

[13] Schimanski CC, Frerichs K, Rahman F, et al. High miR-196a levels promote the oncogenic phenotype of colorectal cancer cells. World J Gastroenterol, 2009,15: 2089-2096.

(本文編輯：屠振興)

EffectsofmicroRNA-196ainhibitorysequencesonHOXB8expressioninhumanpancreaticcancerPANC1cells

LIUMing-hao,DUYi-qi,LIUJian-qiang,GAOJun,WUHong-yu,GONGYan-fang,LIZhao-shen.

DepartmentofGastroenterology,ChanghaiHospital,SecondMilitaryMedicalUniversity,Shanghai200433,China

LIZhao-shen,Email:zhsli@81890.net

ObjectiveTo investigate the effects of microRNA-196a(miR-196a) inhibitory sequences transfection on HOXB8 expression in PANC1 cells.MethodsPANC1 cells were divided into control group, miR-196a inhibitory sequences group and siRNA control group. Liposomal transfection method was applied to transfect miR 196a inhibitory sequences and siRNA control into PANC1 cells. RT-PCR and Western blot were used to detect the expressions of miR-196a and HOXB8 mRNA and protein.ResultsAfter miR-196a inhibitory sequences transfection, when compared with that of siRNA control group, the expression of miR-196a was significantly decreased (0.05±0.054vs. 0.839±0.025,t=3.12,P<0.05); and the expression of HOXB8 mRNA was significantly increased by 1.57 folds (2.20±0.07vs. 1.29±0.10,t=3.86,P<0.05), the expression of HOXB8 protein was also obviously increased (0.90±0.03vs. 0.40±0.10,t=3.11,P<0.05).ConclusionsMicroRNA-196a down-regulates the expression of HOXB8.

Pancreatic neoplasms; MicroRNA; MicroRNA-196a; HOXB8

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2013.01.005

國(guó)家自然基金面上項(xiàng)目(30971344)；上海市科委基礎(chǔ)研究重點(diǎn)項(xiàng)目(11JC1416402)

200433 上海，第二軍醫(yī)大學(xué)長(zhǎng)海醫(yī)院消化內(nèi)科

李兆申，Email:zhsli@81890.net

2011-07-18)