高孟春，李亞惠，張 優(yōu)，張 健，任 云，趙從從

（中國(guó)海洋大學(xué)1.海洋環(huán)境與生態(tài)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；2.環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，山東 青島266100）

高氯酸鹽是1種具有高度擴(kuò)散性的持久性有毒污染物，被廣泛地應(yīng)用在軍工生產(chǎn)、煙火工業(yè)、皮革加工等領(lǐng)域。一旦高氯酸鹽排入水體后，由于其具有化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定和水溶性高的特點(diǎn)，在自然水系中流動(dòng)性很強(qiáng)，能持續(xù)遷移造成大范圍的地表水和地下水污染［1－2］。人體攝入高氯酸鹽后，它能干擾甲狀腺素的合成和分泌，影響人體正常的新陳代謝［3－4］。高氯酸鹽去除技術(shù)主要有離子交換法、膜分離法和生物還原法。離子交換法［5］和膜過(guò)濾法［6－7］能有效地去除水中高氯酸鹽，但存在高濃度高氯酸鹽的再生液或濃縮液需后續(xù)處理的問(wèn)題。生物還原法是指在缺氧條件下通過(guò)高氯酸鹽還原菌將高氯酸鹽還原為無(wú)毒的，是一種經(jīng)濟(jì)、有效和安全的高氯酸鹽去除技術(shù)。根據(jù)電子供體和碳源的不同，高氯酸鹽還原菌可分為異養(yǎng)微生物和自養(yǎng)微生物。異養(yǎng)高氯酸鹽還原菌以有機(jī)物作為碳源和電子供體，而自養(yǎng)高氯酸鹽還原菌以無(wú)機(jī)碳作為碳源，用S0、Fe0、H2和S2O2－3等作為電子供體。與異養(yǎng)高氯酸鹽還原菌相比，自養(yǎng)高氯酸鹽還原菌具有污泥產(chǎn)量低、不需添加有機(jī)碳源的特點(diǎn)，出水中有機(jī)物及微生物產(chǎn)物含量較低。以H2作為電子供體還原高氯酸鹽的研究結(jié)果表明［12－13］，氫自養(yǎng)還原高氯酸鹽具有較好的處理效果。其中，氫自養(yǎng)高氯酸鹽還原菌是完成微生物還原高氯酸鹽的關(guān)鍵。但是，目前開展氫自養(yǎng)高氯酸鹽還原菌培養(yǎng)馴化的研究相對(duì)較少。本文分別以厭氧污泥作為接種污泥和氫氣作為電子供體，系統(tǒng)地研究了氫自養(yǎng)高氯酸鹽還原菌的培養(yǎng)馴化過(guò)程，研究成果可為氫自養(yǎng)還原高氯酸鹽反應(yīng)器提供高效的氫自養(yǎng)高氯酸鹽還原菌。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

接種污泥取自青島市李村河污水處理廠的厭氧消化污泥。培養(yǎng)基由基礎(chǔ)培養(yǎng)基、微量元素和磷酸鹽緩沖液組成?；A(chǔ)培養(yǎng)基和微量元素組分分別見表1和2。磷酸鹽緩沖液（20mmol／L，K2HPO3∶KH2PO3＝1∶1）確保體系中pH值穩(wěn)定。

表1 基礎(chǔ)培養(yǎng)基組成Table 1 Composition of basic medium

表2 微量元素組成Table 2 Composition of trace elements ／g·L－1

1.2 分析方法

2 培養(yǎng)馴化過(guò)程

本研究采用周期運(yùn)行培養(yǎng)方式，同時(shí)進(jìn)行3個(gè)平行試驗(yàn)。將從污水處理廠取回的厭氧污泥靜置5h后棄去上清液，厭氧污泥的 MLSS為17.06g／L，取50mL注入500mL的厭氧瓶中，加入經(jīng)N2／CO2混合氣（N2∶CO2＝4∶1，V∶V）脫氧的250mL營(yíng)養(yǎng)鹽溶液。厭氧瓶中最初的濃度約為300mg／L，調(diào)節(jié)pH約為7.2，通入N2／CO2混合氣體3min，排除其上部空間的氧氣后，立即用丁基橡膠塞封住瓶口，再用鋁封進(jìn)一步密封。用注射器抽空反應(yīng)器內(nèi)液面上部的N2／CO2混合氣體，將氫氣發(fā)生器產(chǎn)生的H2（100mL／min）通過(guò)不銹鋼針向反應(yīng)器內(nèi)注入直至飽和（約3min），保證厭氧瓶的上部空間充有一定量的氫氣。將封裝好的厭氧瓶固定于25℃恒溫?fù)u床中培養(yǎng)，振蕩頻率為120r·min－1。培養(yǎng)馴化過(guò)程中定期取樣分析厭氧瓶中、、Cl－、pH、污泥濃度及微生物群落結(jié)構(gòu)變化。當(dāng)培養(yǎng)馴化周期穩(wěn)定在一定值時(shí)，氫自養(yǎng)高氯酸鹽還原菌培養(yǎng)馴化過(guò)程結(jié)束。

3 結(jié)果與討論

3.1 培養(yǎng)馴化過(guò)程中濃度的變化

培養(yǎng)馴化過(guò)程中，厭氧瓶中高氯酸鹽的起始控制濃度約為300mg／L，在厭氧條件下氫自養(yǎng)高氯酸鹽還原菌以H2作為電子供體將高氯酸鹽先還原為次氯酸鹽和亞氯酸鹽，最終還原為無(wú)毒的Cl－和O2，不同的培養(yǎng)馴化周期的濃度變化如圖1所示。

圖1 培養(yǎng)馴化過(guò)程中ClO－4濃度及去除率的變化Fig.1 Change of ClO－4concentration and removal efficiency during the enrichment and cultivation

3.2 培養(yǎng)馴化過(guò)程中pH的變化

培養(yǎng)馴化氫自養(yǎng)高氯酸鹽的適宜pH值為7左右。本研究采用磷酸鹽緩沖液確保體系中pH值穩(wěn)定，每個(gè)馴化周期初期pH值調(diào)至7.2左右，不同的培養(yǎng)馴化周期Cl－的濃度變化如圖2所示。

圖2 培養(yǎng)馴化過(guò)程中pH的變化Fig.2 Change of pH during the enrichment and cultivation

由圖2可知，在不同培養(yǎng)馴化周期內(nèi)厭氧瓶反應(yīng)體系中均出現(xiàn)了pH的上升，且培養(yǎng)馴化周期時(shí)間越長(zhǎng)，pH上升幅度越大。第1培養(yǎng)馴化周期內(nèi)，反應(yīng)體系pH由最初的7.2逐步上升到8.7，但試驗(yàn)中及時(shí)更換培養(yǎng)基因，沒(méi)有造成pH過(guò)高現(xiàn)象。第2培養(yǎng)馴化周期縮短至4天，反應(yīng)體系pH由最初的7.3升至7.8。隨著培養(yǎng)馴化時(shí)間的增加，每個(gè)馴化周期內(nèi)反應(yīng)體系pH上升幅度繼續(xù)減小，反應(yīng)體系pH穩(wěn)定在7.1～7.6，滿足氫自養(yǎng)高氯酸鹽生長(zhǎng)、發(fā)育和繁殖的條件。

3.3 培養(yǎng)馴化過(guò)程中污泥濃度的變化

污泥濃度以蛋白質(zhì)濃度表征，不同的培養(yǎng)馴化周期蛋白濃度的濃度變化如圖3所示。由圖3可知，在整個(gè)培養(yǎng)馴化過(guò)程中厭氧瓶反應(yīng)體系中蛋白質(zhì)含量由最初的156mg／L到第8培養(yǎng)馴化周期末降至102mg／L，馴化后期有所上升，培養(yǎng)馴化結(jié)束時(shí)含量為117mg／L。在以厭氧泥為接種泥的氫自養(yǎng)高氯酸鹽還原菌馴化過(guò)程中，馴化初期剛接種的污泥中有一部分細(xì)菌因不適應(yīng)環(huán)境而被淘汰，馴化后期反應(yīng)體系內(nèi)氫自養(yǎng)高氯酸鹽還原菌得到增殖，富集產(chǎn)生氫自養(yǎng)高氯酸鹽還原菌污泥沉降性能較好，且具有較高的高氯酸鹽還原活性。

圖3 培養(yǎng)馴化過(guò)程中蛋白質(zhì)含量的變化Fig.3 Change of protein content during the enrichment and cultivation

3.4 培養(yǎng)馴化過(guò)程中微生物群落結(jié)構(gòu)的變化

3.4.1 DNA提取與PCR擴(kuò)增 為了系統(tǒng)地研究厭氧污泥培養(yǎng)馴化過(guò)程中微生物群落結(jié)構(gòu)的演替變化，分別從厭氧接種污泥和第8、24和45天的樣品中提取DNA，對(duì)應(yīng)的編號(hào)分別為1、2、3、4，將樣品的 DNA提取結(jié)果，與λ－Hind III digest DNA Marker相對(duì)照，其分子量在23kb左右，與細(xì)菌基因組的大小相同，所提DNA為較完整的細(xì)菌基因組DNA。與Marker相比，目標(biāo)條帶較清晰，亮度和純度較好，沒(méi)有出現(xiàn)明顯的拖帶現(xiàn)象，無(wú)短片段出現(xiàn)，說(shuō)明已經(jīng)獲得了較完整的微生物總DNA且適宜于PCR擴(kuò)增反應(yīng)。將提取的DNA梯度稀釋后進(jìn)行16srDNA片段PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物的凝膠電泳圖如圖4所示。

圖4 培養(yǎng)馴化過(guò)程中污泥樣品PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖Fig.4 Agarose gel electrophoresis of PCR amplified 16SrDNA during the enrichment and cultivation

由圖4可知，4個(gè)樣品均得到良好的擴(kuò)增效果，條帶清晰且無(wú)非特異性擴(kuò)增。與DL2000DNA Marker（M）對(duì)照發(fā)現(xiàn)，條帶的亮度較好，且陰性對(duì)照（Nc）無(wú)污染，片段大小約為230bp，證實(shí)為16srDNA V3區(qū)特異性片段。

3.4.2 DGGE條帶分析 不同馴化時(shí)期污泥樣品的DGGE條帶圖譜見圖5所示。污泥中微生物較高的菌種豐富度反映出系統(tǒng)良好的微生物多樣性。DGGE圖譜中不同樣品的條帶之間存在明顯的差異，這說(shuō)明微生物的種群結(jié)構(gòu)在不斷地發(fā)生著演替變化。

以樣品1為標(biāo)準(zhǔn)，用Quantity One軟件對(duì)DGGE凝膠各泳道的條帶進(jìn)行比較（見圖6）。

圖5 培養(yǎng)馴化過(guò)程中污泥樣品的DGGE譜圖Fig.5 DGGE profile of sludge during the enrichment and cultivation

圖6 不同泳道DGGE條帶對(duì)比圖譜Fig.6 Comparative profile of DGGE in different lanes

泳道中條帶的粗細(xì)程度與樣品條帶在DGGE凝膠上的密度大小相對(duì)應(yīng)。條帶粗、黑表明細(xì)菌密度大，條帶細(xì)、淡則表明細(xì)菌密度小。雖然在整個(gè)馴化過(guò)程中微生物種群結(jié)構(gòu)發(fā)生了較大的改變，但是條帶5、8、14、16、17、18、20保持了一定的穩(wěn)定性，說(shuō)明它們所代表的細(xì)菌一直存在于整個(gè)系統(tǒng)的運(yùn)行期間，具有較強(qiáng)的適應(yīng)性。條帶1對(duì)應(yīng)的微生物種群在泳道4（第45天）中才發(fā)現(xiàn)，而在此泳道中未發(fā)現(xiàn)條帶2、6、9、10、11、15、19所對(duì)應(yīng)的的微生物種群。條帶3、7、13對(duì)應(yīng)的微生物種群只出現(xiàn)在泳道2（第8天）、3（第24天）。同樣在泳道2中未發(fā)現(xiàn)條帶12所對(duì)應(yīng)的微生物種群。這說(shuō)明了在整個(gè)馴化過(guò)程中，微生物群落的結(jié)構(gòu)和數(shù)量都發(fā)生了復(fù)雜的變化。

3.4.3 微生物種群結(jié)構(gòu)相似性分析 采用戴斯系數(shù)（Dice coefficient）計(jì)算出各樣品的相似性（見表3），從而對(duì)各樣品之間的相似性進(jìn)行比較。樣品2（第8天）與接種污泥相似性較低，為67.4%，樣品3（第24天）與接種污泥的相似性上升為69.5%，達(dá)到最高，隨后相似性降低。樣品4（第45天）與接種污泥的相似性達(dá)到最低，僅為35.0%。樣品2和樣品3相似性最高，可達(dá)83.6%。樣品2和樣品4的相似性僅為42.9%。這說(shuō)明反應(yīng)體系內(nèi)微生物群落發(fā)生了復(fù)雜的變化，微生物系統(tǒng)存在較高的多樣性。

表3 DGGE圖譜相似性矩陣Table 3 Dice coefficients（Cs）comparing the similarities of DGGE fingerprints

4 結(jié)論

（1）在45天的氫自養(yǎng)厭氧馴化過(guò)程中，厭氧接種污泥能在短暫的適應(yīng)期后表現(xiàn)出較高的高氯酸鹽降解活性，并且隨著馴化過(guò)程的進(jìn)行降解速度顯著提高，最終實(shí)現(xiàn)對(duì)高氯酸鹽的高效去除，適宜作為后續(xù)反應(yīng)器的接種污泥。

（2）馴化各周期的高氯酸鹽還原降解過(guò)程中都出現(xiàn)了pH的上升，且馴化周期時(shí)間越長(zhǎng)，pH上升幅度越大。但實(shí)驗(yàn)中及時(shí)更換培養(yǎng)基使馴化過(guò)程中pH變化基本始終在中性范圍內(nèi)，因此沒(méi)有造成對(duì)微生物還原高氯酸鹽過(guò)程的抑制現(xiàn)象。

（3）馴化過(guò)程中，污泥蛋白含量相對(duì)馴化初期有一定程度的下降，但未影響高氯酸鹽去除效果，表明馴化富集產(chǎn)生的還原菌具有較高的高氯酸鹽還原活性。

（4）采用PCR－DGGE技術(shù)對(duì)接種厭氧污泥的反應(yīng)體系內(nèi)不同馴化時(shí)期的污泥進(jìn)行微生物群落結(jié)構(gòu)分析和對(duì)比，結(jié)果說(shuō)明體系內(nèi)具有良好的微生物多樣性，馴化過(guò)程中微生物群落結(jié)構(gòu)發(fā)生動(dòng)態(tài)變化，逐漸形成具有高氯酸鹽還原性能的微生物群落。

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