侯秀璋，馬曉燕，惠昱晨，常 海

（1西北工業(yè)大學(xué)空間應(yīng)用物理與化學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西省高分子科學(xué)與技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西 西安710129；2西安近代化學(xué)研究所，陜西 西安 710065）

酶生物燃料電池是直接利用酶進(jìn)行催化燃料氧化，將生物質(zhì)化學(xué)能轉(zhuǎn)化為電能的一種裝置，是一種真正意義上的能量轉(zhuǎn)化率高、生物相容性好、工作環(huán)境溫和、原料可再生的綠色能源，并有望應(yīng)用在疾病診療、環(huán)境保護(hù)以及航空航天等領(lǐng)域。但酶生物燃料電池由于使用壽命短、功率密度低或輸出電流小等缺點(diǎn)，目前還處于理論研究階段，尚未實(shí)現(xiàn)大規(guī)模的商業(yè)化應(yīng)用。酶生物燃料電池的效率與酶電極的結(jié)構(gòu)直接相關(guān)，其中起決定作用的包括氧化還原酶的特性、電池中電子傳遞方式以及酶在電極上的固定等因素。本文主要對(duì)目前文獻(xiàn)報(bào)道的生物燃料電池酶電極中氧化還原酶的種類、影響電子傳遞的因素以及酶的固定化等方面的研究進(jìn)展進(jìn)行了分析歸納，并提出了今后的發(fā)展趨勢。

1 氧化還原酶

在酶生物燃料電池中，酶可以溶解在底物燃料中或是固定在電極上，由于酶在電極上固定可以減少酶的流失提高催化效率，并且受外環(huán)境影響小，因此具有更廣泛的應(yīng)用。圖1是一個(gè)單極室葡萄糖-O2生物燃料電池。中介體吡咯并喹啉（PPQ）修飾的葡萄糖氧化酶（GOx）電極作為電池的陽極，固定馬來酰亞胺（COx）修飾的細(xì)胞色素氧化酶（Cytc）作為陰極。電池工作時(shí)，GOx的輔酶因子FAD（黃素腺嘌呤二核苷酸）穿過酶外殼擴(kuò)散出來，與固定在電極上的中介體以共價(jià)鍵合的方式結(jié)合，使葡萄糖最終轉(zhuǎn)化為葡萄糖酸，產(chǎn)生的電子通過中介體傳遞到電極上，H+擴(kuò)散到陰極；在陰極區(qū)，O2從電極上得到電子，在COx修飾的Cytc的作用下與H+反應(yīng)，生成H2O。

在早期研究中，大多數(shù)生物燃料電池只是在陽極使用生物氧化酶，而陰極與一般的燃料電池一樣是以氧氣作為氧化劑，這種生物燃料電池至今仍在研究中。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，在陰極使用還原酶構(gòu)筑生物燃料電池可以提高電池的功率密度，因此這也成為該領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。

1.1 陽極氧化酶

圖1 酶生物燃料電池基本原理圖[1]

陽極氧化酶的作用是催化氧化生物質(zhì)，并能將釋放的電子有效的傳遞給電極，保證電池具有較高的輸出功率。酶的組成與結(jié)構(gòu)不同，其催化轉(zhuǎn)化效率不同，可催化的底物燃料也不同。常見的陽極氧化酶有葡萄糖氧化酶（GOx）、纖維二糖脫氫酶（CDH）、果糖脫氫酶（FDH）等。

葡萄糖氧化酶是一種包含黃素腺嘌呤二核苷酸輔酶因子且具有生物催化活性和生物化學(xué)穩(wěn)定性的氧化還原酶[2-3]。由于葡萄糖氧化酶的輔酶因子深埋在酶蛋白質(zhì)中，阻礙了其與電極之間的直接電子傳遞，因此許多研究者采用不同的納米材料、導(dǎo)電聚合物等實(shí)現(xiàn)直接電子傳遞的目的[4-5]。

纖維二糖脫氫酶也可以將葡萄糖作為底物，能夠在生物燃料電池中實(shí)現(xiàn)直接電子傳遞而引起了廣泛關(guān)注[6-9]。纖維二糖脫氫酶包含F(xiàn)AD和亞鐵血紅素，其中FAD催化底物氧化，同時(shí)亞鐵血紅素與電極材料之間形成電耦合作用[10]。Feifel等[11]以二氧化硅納米顆粒為基體，將纖維二糖脫氫酶固定在超分子結(jié)構(gòu)體系中制備生物電極，產(chǎn)生的電流密度高于纖維二糖脫氫酶自組裝形成的納米生物分子層電極，兩種結(jié)構(gòu)的酶電極均可完成電子的直接和間接傳遞。

纖維二糖脫氫酶對(duì)葡萄糖的催化效率比葡萄糖氧化酶低，理論上纖維二糖脫氫酶的底物應(yīng)該是纖維二糖，但其對(duì)乳糖也具有很高的催化氧化效率。

果糖脫氫酶可以催化氧化果糖構(gòu)筑生物燃料電池。果糖脫氫酶的固定化與纖維二糖脫氫酶類似，果糖脫氫酶攜帶一個(gè)FAD和一個(gè)亞鐵血紅素c，可為電極提供直接電子傳遞的電池模式[12]。

除了上述幾種包含輔酶因子的陽極氧化酶外，還有以乙醇脫氫酶（ADH）催化氧化發(fā)酵乙醇實(shí)現(xiàn)直接電子傳遞的生物燃料電池[13-14]。

1.2 陰極還原酶

在陰極添加還原酶，可以更高效地催化陰極的還原反應(yīng)，提高電池輸出功率?；诖?，科學(xué)家們探索并發(fā)展了多種陰極還原酶，成為酶生物燃料電池領(lǐng)域一個(gè)新的發(fā)展方向。

藍(lán)多銅氧化酶類（BMCOs）家族中包含多種氧化還原酶，主要有漆酶（Lc）、膽紅素氧化酶（BOx）、抗壞血酸鹽氧化酶（AOx）、血漿銅藍(lán)蛋白（Cp）。其中漆酶和膽紅素酶是研究較多的陰極還原酶，氧化還原電勢高，可實(shí)現(xiàn)生物燃料電池中的直接電子傳遞。

漆酶在稀酸介質(zhì)中（pH值為 4～5）通常會(huì)顯示很高的活性，但是在有氯離子存在下其活性會(huì)受到抑制。Javier等[15]將漆酶分子與4-[2-氨乙基]苯甲酸鹽（AEBA）功能化的石墨陰極表面以定向共價(jià)耦合的方式連接實(shí)現(xiàn)了直接電子傳遞，Zn作為電池陽極，制備了 Zn-AEBA漆酶電極，其電流密度達(dá)2977 μA/cm2，開路電壓為0.41 V時(shí)，功率密度達(dá)1190 μW/cm2。Thorum 等[16]以蒽-2-甲硫醇（AMT）改性金電極的表面，研究漆酶在該電極上的催化活性，發(fā)現(xiàn)蒽-2-甲硫醇可有利于漆酶的吸附，漆酶催化O2還原的最高開路電壓可達(dá)1.13 V。

膽紅素氧化酶由于能夠進(jìn)行直接電子傳遞，并長期保持電極催化的穩(wěn)定性而備受關(guān)注。Murata等[17]研究了膽紅素氧化酶與納米金粒子電極之間的直接電子傳遞，結(jié)果表明，膽紅素氧化酶修飾納米金粒子電極的電流密度高達(dá)5.2 mA/cm2，同時(shí)在保持48 h的連續(xù)測量后，電流密度仍然是初始值的90%。此外該作者還構(gòu)筑了果糖/O2的直接電子傳遞生物燃料電池，以炭布作電池電極的基板，在 360 mV的靜態(tài)工作條件下，最大的電流密度和最大的功率密度分別為2.6 mA和0.66 mW/cm2；而在300 mV的攪拌條件下，最大電流密度和最大功率密度提高到4.9 mA和0.87 mW/cm2。這表明膽紅素氧化酶在提高生物燃料電池性能方面具有明顯的優(yōu)勢。

藍(lán)多銅氧化酶類的結(jié)構(gòu)如圖2所示，大多數(shù)藍(lán)多銅氧化酶的催化部位包括4個(gè)銅原子：在T1部位（Cu-T1）可從底物中獲得電子，可將電子直接轉(zhuǎn)移到電極上；T2/T3為銅電子簇（Cu-T23），此處使O2還原成水。一些藍(lán)多銅氧化酶還具有更復(fù)雜的結(jié)構(gòu)，如人工合成的血漿銅藍(lán)蛋白包含 6個(gè) Cu離子、3個(gè)Cu-T1和3個(gè)Cu-T23[如圖2(c)]。藍(lán)多銅氧化酶類修飾的陰極催化效率高，電流密度可達(dá)毫安級(jí)（mA/cm2），但是催化效率受到O2在電極表面的擴(kuò)散的限制[17-18]。H2O2可代替 O2作陰極的氧化劑被催化還原。

圖2 藍(lán)多銅氧化酶的晶體結(jié)構(gòu)[19]

辣根過氧化物酶（HRP）和微過氧化物酶-11（MP-11）在不同的改性電極表面固定，酶在改性后的電極上能夠保持其生物活性以及原始結(jié)構(gòu)，并且電極顯示出較高的電子傳遞效率，可以作為直接電子傳遞的生物陰極[20-23]。

2 電子介體電極

由于酶的活性中心常常被深埋在蛋白質(zhì)的多肽鏈中不利于電子的傳遞，使得氧化還原中心到電極表面的電子傳遞不易被檢測。因此，需要氧化還原中介體的存在以驅(qū)動(dòng)生物電催化過程，提高酶電極之間的電子傳遞效率，如圖3(b)所示，中介體在酶與電極之間起傳遞電子的作用。中介體可以分散在溶液中，也可以采用復(fù)合膜包覆，或與酶一起在基體材料中固定等形式存在。

常用的小分子中介體包括：二茂鐵及其衍生物、亞甲基藍(lán)、醌類、亞鐵氰化物以及帶有包括鄰二氮雜菲衍生物（PDs）一類的無機(jī)配體金屬復(fù)合物[24-28]等。而黃素、奎寧這樣的生物小分子可以將電子直接轉(zhuǎn)移到電極上。Li等[29]以合成的聚-2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酰膽堿-co-p-乙烯基苯硼酸-co-乙烯基二茂鐵（PMVF）為電子傳遞介質(zhì)，GOx作為酶催化劑，在溫和條件下，使聚乙烯醇（PVA）鏈與GOx相連。在苯硼酸和羥基之間通過選擇性反應(yīng)，使PMVF與PVA兩種聚合物立即形成凝膠。采用旋轉(zhuǎn)涂布技術(shù)，在金電極表面上構(gòu)筑PMVF/GOx-PVA重復(fù)的多層結(jié)構(gòu)。GOx對(duì)葡萄糖氧化產(chǎn)生的電流可達(dá)0.38 V（vs. Ag/AgCl），且電流隨著PMVF/GOx-PVA層數(shù)的增加而增加，在凝膠中實(shí)現(xiàn)了分子在每一層和自由分散的基質(zhì)的表面間的電子轉(zhuǎn)移，可作為研究生物電子設(shè)備的有效方法。

圖3 兩種電子傳遞方式[1]

一些氧化還原聚合物也可以作為電子中介體，改變電極電位，提高電流密度。Zafar等[30]發(fā)現(xiàn)葡萄糖脫氫酶/鋨氧化還原聚合物（FADGDHs/Ospolymer-basd），如圖4，電極對(duì)于葡萄糖基體具有高電流密度、高靈敏度和較寬的線性范圍。同時(shí)酶經(jīng)過去糖基化后體積縮小，有效地提高了酶和電極之間的電接觸點(diǎn)范圍，進(jìn)而提高了電子傳遞效率和電流密度。

圖4 鋨-聚[鋨(4,4′-二甲基-2,2′-聯(lián)吡啶) 2(聚乙烯異丁醚)10氯] +的結(jié)構(gòu)[30]

3 直接電子傳遞電極

雖然中介體提供了電子傳遞的有效途徑，但是由于部分中介體具有毒性，會(huì)使酶失活，而采用直接電子傳遞方式可以緩解這一問題。直接電子傳遞是指酶的活性中心催化底物燃料氧化，電子從底物分子直接傳遞到電極上[圖3(a)]，因此成為構(gòu)筑新型生物燃料電池、傳感器的理想方式。

目前，導(dǎo)電聚合物（如聚吡咯、聚噻吩、聚苯胺等）、碳納米管（CNTs）、納米纖維、納米粒子（NPs）、有序的介孔硅材料和有機(jī)客體分子等常被用來構(gòu)筑直接電子傳遞電極。導(dǎo)電聚合物以其特殊的導(dǎo)電性、機(jī)械強(qiáng)度、耐腐蝕等性能，在酶固定化方面得以研究，以提高直接電子傳遞效率。Homma等[31]將酸性磷酸酶（ACP）以共價(jià)鍵合的方法固定在聚苯胺/聚丙烯酸復(fù)合膜（PANI/PAA）上，復(fù)合膜電沉積到金電極上，作為生物燃料電池的陽極。該電極的最大輸出功率為 6.0 μW/cm2，是無PANI/PAA復(fù)合膜時(shí)的70倍。

碳納米管、納米粒子（NPs）、納米纖維、介孔材料因其具有獨(dú)特的表面效應(yīng)可提高載酶量及電極穩(wěn)定性，且質(zhì)輕、多孔等特性，可促進(jìn)直接電子傳遞效率，用以制備具有納米結(jié)構(gòu)特征的酶電極，構(gòu)筑生物燃料電池。Yabuki等[32]將含有納米纖維素的離子液體涂布在電極表面，再使電極沉浸在蒸餾水中以除去離子液體，此時(shí)膜上的酶依然可以保持活性，穩(wěn)定性測試結(jié)果表明，該酶電極可在6個(gè)月內(nèi)對(duì)葡萄糖進(jìn)行檢測。

也有研究者認(rèn)為直接電子傳遞與摻雜在碳納米管中的金屬粒子有關(guān)，由于雜質(zhì)金屬與酶的協(xié)同作用使底物燃料氧化得更徹底，從而進(jìn)一步提高了酶電極的直接電子傳遞效率[33]。

酶與電極之間的直接電子傳遞的優(yōu)化對(duì)于提高生物燃料電池催化效率是至關(guān)重要的，而轉(zhuǎn)基因技術(shù)為這一目標(biāo)的實(shí)現(xiàn)提供了新的發(fā)展思路。Holland等[34]利用基因修飾技術(shù)對(duì)葡萄糖氧化酶進(jìn)行了修飾，使其在活性點(diǎn)附近帶有一個(gè)自由的硫醇基，有利于馬來酰亞胺修飾的納米金粒子在酶上特定位置的負(fù)載。將納米金粒子修飾的酶固定到電極上，實(shí)現(xiàn)了酶-電極之間的直接電子傳遞，顯示出轉(zhuǎn)基因技術(shù)在基于直接電子傳遞的第三代生物燃料電池中的潛在應(yīng)用。

與此同時(shí)，去糖基化的葡萄糖氧化酶[35-36]可以縮短酶的氧化還原中心與電極表面的距離，提高直接電子傳遞效率。其它氧化還原酶也可以嘗試去糖基化的方法，縮減酶的尺寸從而改善酶與電極表面的電子傳遞途徑，提高電流密度。

4 酶的固定化

早期燃料電池是將酶溶于溶液中，由于酶在溶液中只能保持?jǐn)?shù)天，所以電池的壽命很短，而將酶固定在電極上可以保持酶的活性，延長電池的使用周期。酶的固定化方法主要包括吸附、交聯(lián)、共價(jià)鍵合、脫輔酶的重構(gòu)以及聚合物等材料的包覆。

物理吸附是最簡單的酶固定化方法，酶蛋白的活性中心不易被破壞，但相互作用較弱，需進(jìn)一步提高載酶量及酶的穩(wěn)定性。研究不同CDHs的直接電子傳遞能力，將CDHs吸附于石墨電極或單壁碳納米管（SWCNTs）上，發(fā)現(xiàn)SWCNTs能夠增加電催化電流[37]。

包覆是將酶限制在聚合物基體、溶膠-凝膠以及氧化還原水凝膠中，或者是將酶包裹在半滲透膜中，不僅可以使酶自由移動(dòng)，同時(shí)還可以阻止酶和小分子介體的流失。Latonen等[38]采用摻雜磺化聚苯乙烯（PSS?）且具有二層有序結(jié)構(gòu)的聚(3,4-亞乙二氧基噻吩)（PEDOT）包覆毛栓菌漆酶（ThL）制備在陰極催化 O2還原的酶電極，致密的 PEDOT-PSS?復(fù)合膜可防止ThL流失提高載酶量，并可實(shí)現(xiàn)ThL與電極間的直接電子傳遞，當(dāng)選擇 pH=4.5時(shí)，該電極的穩(wěn)定性最佳。

由于酶及固定化材料具有不同的功能化基團(tuán)，通過共價(jià)鍵合的方法可使酶直接固定在金屬及納米材料的表面。交聯(lián)的方法使酶形成三維網(wǎng)狀的聚合物，但同時(shí)降低了酶的穩(wěn)定性及活性。目前研究較多的是采用共價(jià)鍵合與交聯(lián)相結(jié)合的方法制備自組裝復(fù)合膜。Aquino等[39]利用層層組裝技術(shù)（LBL）制備了乙醇/O2生物燃料電池。乙醇脫氫酶（ADH）和樹枝狀的聚酰亞胺利用LBL在碳紙上固定化，可更好地控制酶在電極上的沉積減少酶的消耗，產(chǎn)生的功率密度為0.12 mW/cm2。但是由于存在氣體分散層（GDL）以致其穩(wěn)定性不佳。Salimi等[40]在玻碳電極上以多層組裝的方法構(gòu)筑高穩(wěn)定性的葡萄糖氧化酶電極，硫脲（TU）作共價(jià)鍵合的交聯(lián)劑，二茂鐵甲醇作電子傳遞介體，經(jīng)測試葡萄糖固定化酶顯示優(yōu)異的電催化活性，并且擁有4個(gè)雙分子層的TU/GOx穩(wěn)定性良好，重現(xiàn)性高，酶可以在多層結(jié)構(gòu)中保持活性，靈敏度達(dá)5.73 μA/(mmol·cm2)。

通過電化學(xué)還原將金電極、石墨電極、玻碳電極（GC）表面共價(jià)改性吸附芳基重氮鹽，然后將酶膜接枝到功能化的電極上，形成的電極膜穩(wěn)定性好，輸出電壓高。Pellissier等[41]將葡萄糖氧化酶自組裝單層膜負(fù)載在功能化的玻碳電極的表面，該電極可在6個(gè)星期內(nèi)保持酶的大部分活性。

另外，殼聚糖是一種天然高分子，因其具有良好的生物相容性以及血液相容性，且易進(jìn)行一些化學(xué)修飾和改性（如酯化、烷基化、氧化、?；?、螯合等），可作為固載酶的基體材料。Yarman等[42]將微過氧化物酶-11固定在殼聚糖金納米粒子基體中，催化過氧化氫在陰極還原，發(fā)現(xiàn)微過氧化物酶-11在殼聚糖金納米粒子基體中分散性良好，可檢測苯醌在陰極的還原信號(hào)，相同的傳感器原理也可以用在芳香族藥物中。

5 總結(jié)與展望

近幾年，酶生物燃料電池的功率密度達(dá)到了 1 mW/cm2，使微型電子設(shè)備的成功應(yīng)用成為可能。但是酶生物燃料電池需進(jìn)一步提高功率密度和能量效率，選擇生物相容性好的天然酶、人工酶以及目前研究較多的酶基因修飾技術(shù)和去糖基化酶也可實(shí)現(xiàn)酶與電極間的直接電子傳遞，提高電流密度；同時(shí)小分子中介體、氧化還原聚合物中介體的研究也促進(jìn)了酶電極的發(fā)展；此外采用導(dǎo)電聚合物、碳納米管等材料修飾電極需要保持材料性能的同時(shí)使酶具有更高的催化活性。而決定酶生物燃料電池性能的關(guān)鍵是酶電極的穩(wěn)定性，在對(duì)催化活性位點(diǎn)保持連續(xù)的燃料供給的同時(shí)要確保酶與電極之間有效的電子傳遞，因此選擇合適的酶固定化方法至關(guān)重要。研究新方法和新材料來完善酶電極，最大程度上提高載酶量，如通過自組裝方法使酶固定在三維有序的復(fù)合膜結(jié)構(gòu)中或在改性電極上負(fù)載酶膜等。

通過選擇高效的催化氧化還原酶以及合適的酶固定化方法，制備具有更高效率的酶電極，使酶生物燃料電池在醫(yī)用、環(huán)境保護(hù)等方面具有更廣闊的應(yīng)用前景。綜上所述，隨著國內(nèi)外對(duì)酶電極研究的不斷深入，電子傳遞方式及其影響因素、酶活性與耐久性的提高等會(huì)成為今后一段時(shí)間的研究重點(diǎn)。

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