明凱利，張 梅，王樹春，臧家業(yè)，金濱濱，吳佐浩，王能飛

（1成都中醫(yī)藥大學藥學院，四川 成都 611130；2國家海洋局第一海洋研究所，山東 青島 266061）

隨著化石能源漸趨枯竭和環(huán)境的不斷惡化，研發(fā)應用各種新型可再生能源，走可持續(xù)發(fā)展的道路已得到世界各國的普遍共識。當前，在生物質(zhì)能源中生物乙醇作為一種可再生能源，具有燃燒完全、效率高、無污染等特點[1]，因此被認為是最終能夠替代化石燃料的理想能源之一。目前，我國制備纖維素燃料乙醇主要側(cè)重于秸稈、木薯、甘蔗渣和木屑等陸源原料，對利用海洋生物資源特別是用海帶等海藻加工廢棄物制備生物乙醇的相關研究相對較少。

海帶為褐藻的一種，是褐藻膠、甘露醇、碘等褐藻化工產(chǎn)品的主要原料之一。在海帶工業(yè)利用過程中會產(chǎn)生大量的富含碳水化合物及營養(yǎng)鹽等的廢棄物，是極為豐富的可利用資源，其中在海藻酸鈉的生產(chǎn)過程中產(chǎn)生的海帶渣是海帶工業(yè)中比例最大的固體雜質(zhì)[2]。充分利用海帶渣等海帶化工廢棄物，不僅能夠變廢為寶，減少資源的浪費；而且能有效的降低這些廢棄物直接排放帶來的水體富營養(yǎng)化和誘發(fā)赤潮等造成生態(tài)環(huán)境破壞的可能性[3]；此外，利用海帶渣等廢棄物生產(chǎn)附加產(chǎn)品，能降低褐藻相關產(chǎn)業(yè)的成本。

本實驗以海藻酸鈉生產(chǎn)過程中產(chǎn)生的海帶渣為原料，并以當前制備燃料乙醇較常用的玉米秸稈作為對照原料，測定了海帶渣中的纖維成分，并對海帶渣進行了酶解發(fā)酵產(chǎn)乙醇的相關實驗研究。在前期實驗的基礎上，比較了當前較為常用的稀酸、稀堿兩種預處理方式對海帶渣纖維素降解產(chǎn)糖及發(fā)酵產(chǎn)乙醇的效果，初步確立了海帶渣同步糖化發(fā)酵的方式，并研究了南極低溫纖維素酶QP7與常溫酶組成的復配酶降解海帶渣生產(chǎn)乙醇的效果，為進一步深入研究海帶渣制備燃料乙醇作重要實驗基礎和技術參考。

1 材料和方法

1.1 實驗樣品

海帶渣為青島王哥莊海藻公司提供，將海帶渣干燥后所得干渣經(jīng)粉碎，并過40目篩作為實驗原料以備用。

玉米秸稈來自青島當?shù)剞r(nóng)田，干燥后經(jīng)粉碎，并過40目篩作為實驗原料以備用。

產(chǎn)低溫纖維素酶 QP7菌種為本實驗室保存菌種；釀酒高活性干酵母購自湖北安琪酵母股份有限公司。

1.2 樣品纖維成分測定方法

在王玉萬等[4]、薛惠琴等[5]及 Ververis等[6]方法的基礎上，用改良的方法對樣品中的纖維素、半纖維素、木質(zhì)素等進行系統(tǒng)定量分析。具體步驟如下。

（1）實驗操作 準確稱取1 g樣品分別經(jīng)中性洗滌劑處理、2 mol/L鹽酸水解處理、72%硫酸酸化處理、高溫灰化處理等連續(xù)處理步驟，每步處理后的殘渣均干燥至衡重（單位：g），分別為W1、W2、W3、W4。

（2）結(jié)果計算

半纖維素含量=（W1?W2）/樣品重×100%

纖維素含量=（W2–W3）/樣品重×100%

木質(zhì)素含量=（W3–W4）/樣品重×100%

每個樣品成分測定至少 3組平行，結(jié)果取平均值。

1.3 樣品預處理及酶解方法

1.3.1 酸處理

樣品按1 g∶10 mL（2%硫酸）的料液量，裝入三角瓶中封口，120 ℃高溫處理1 h，冷卻后，用堿液調(diào)pH值為中性。

1.3.2 堿處理

樣品按1 g∶10 mL（1%氫氧化鈉）的料液量，裝入三角瓶中封口，120 ℃高溫處理1 h，冷卻后，用酸液調(diào)pH值為中性。

1.3.3 預處理液酶解糖化實驗

將上述酸、堿處理液以25 IU/g樣品的酶量，添加纖維素酶，在溫度為48 ℃，轉(zhuǎn)速為120 r/min的振蕩條件下，酶解62 h。分別取0 h 和 62 h 的酶解液適量，離心后取上清糖化液，分別測還原糖濃度。

1.3.4 還原糖的測定方法

還原糖含量的測定采用 DNS（3,5-二硝基水楊酸）法[7]，所測葡萄糖標準曲線如圖1所示。

2.4 樣品發(fā)酵產(chǎn)乙醇實驗

2.4.1 同步糖化發(fā)酵

（1）將樣品分別按1.3節(jié)中的酸、堿方法處理后，添加酵母發(fā)酵營養(yǎng)物質(zhì)，滅菌后調(diào)pH值，樣品以25 IU/g酶活單位添加纖維素酶，并接種酵母活化液同步進行酶解發(fā)酵。

（2）發(fā)酵條件 酵母接種量 8%、發(fā)酵溫度34 ℃、pH值約5.0、120 r/min振蕩培養(yǎng)。分別測定其發(fā)酵22 h和46 h時乙醇濃度及還原糖含量。

（3）發(fā)酵營養(yǎng)物質(zhì) 酵母粉 0.3%、蛋白胨0.5%、尿素0.02%、硫酸鎂0.4%、磷酸氫二銨0.01%。

2.4.2 分步糖化發(fā)酵

將樣品按1.3.3節(jié)中方法進行酶解62 h后，離心收集糖化液，添加酵母發(fā)酵營養(yǎng)物質(zhì)，接種酵母進行發(fā)酵，具體發(fā)酵條件同2.4.1節(jié)。

2.4.3 乙醇測定方法

采用氣相色譜（GC），用外標法測定發(fā)酵液乙醇含量。氣相色譜條件為：進樣口溫度150 ℃；進樣量 1 μL；載氣 N2流量 25 mL/min，分流量 22 mL/min，隔墊吹掃2 mL/min，尾吹20 mL/min；柱溫由50 ℃程序升溫至100 ℃，升溫速率為10 ℃/min，并在50 ℃和100 ℃分別保持1 min；FID檢測器溫度220 ℃；燃氣H2流量20 mL/min；空氣流量 150 mL/min；色譜柱為 DB-624，30 m × 250 μm ×1.4 μm。

2.5 低溫纖維素酶QP7復配降解實驗

2.5.1 低溫纖維素酶的制備

將產(chǎn)低溫纖維素酶 QP7菌株接種活化，在低溫搖床上150 r/min，15 ℃培養(yǎng)4天。將QP7發(fā)酵后的離心液作為低溫纖維素酶的粗酶液，并測定酶活。

2.5.2 濾紙酶活測定方法

取酶液0.5 mL，加入1.5 mL pH值為5.0的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液和定量濾紙條，于 38 ℃準確保溫1 h，沸水浴20 min，冷卻后定容至20 mL，在波長540 nm處測定吸光度，具體方法參考文獻[8]。

2.5.3 QP7酶復配降解實驗方法

樣品以1 g∶10 mL的料液比經(jīng)酸處理后，其中對照組一只加適量的低溫菌QP7所產(chǎn)酶液，對照組二只加常溫纖維素酶，實驗組同時加等量總纖維素酶活的QP7酶液和纖維素酶，分別按2.4節(jié)中的方法在相同條件下進行同步糖化發(fā)酵，并測定發(fā)酵22 h的乙醇濃度含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品纖維成分含量測定結(jié)果

表 1為海帶渣和秸稈樣品測得的纖維成分含量，從表1中可以看出海帶渣含有數(shù)量較多的纖維素和半纖維素成分，尤其是纖維素含量達到了28.3%，接近于秸稈的33.6%。纖維素和半纖維素為多糖聚合物，是可以轉(zhuǎn)化為醇類的多糖資源，特別是纖維素，通過酶解轉(zhuǎn)化為單體葡萄糖，進而通過釀酒酵母發(fā)酵作用生產(chǎn)乙醇。實驗表明，含有較高纖維素含量的海帶渣利用潛力較大，具備作為乙醇生物質(zhì)原料的重要優(yōu)勢，對其深入研究意義重大。

表1 樣品纖維成分含量

2.2 海帶渣酸、堿預處理效果比較

酸、堿預處理方法為纖維乙醇預處理技術中較多采用的方法，本實驗分別從樣品預處理后，酶解產(chǎn)糖及發(fā)酵產(chǎn)乙醇兩個方面比較了酸、堿預處理對海帶渣的降解效果，其中酸預處理所用的2%稀酸和堿預處理所用的 1%氫氧化鈉分別為前期濃度優(yōu)化實驗所得。實驗結(jié)果分別為圖2﹑圖3所示。

從圖2可以看出，海帶渣經(jīng)稀酸處理后酶解62 h時還原糖濃度達到了31.1 mg/mL，高于其堿處理的22.6 mg/mL，而秸稈酸、堿處理后酶解62 h時還原糖濃度接近，分別為27.9 mg/mL和26.1 mg/mL，均低于海帶渣經(jīng)酸處理后酶解的糖濃度。由表1知，秸稈中纖維素和半纖維素含量均高于海帶渣的，但降解后的糖濃度卻低于海帶渣的，這可能由于二者的組織結(jié)構(gòu)不同所致，秸稈為陸生木質(zhì)纖維素，結(jié)構(gòu)致密難以徹底降解；而海帶渣為水生植物海帶經(jīng)化學工業(yè)處理后，結(jié)構(gòu)松散，纖維素成分容易剝離，易于降解。從酶解0 h還原糖濃度看，秸稈和海帶渣經(jīng)酸處理的糖濃度均高于堿處理的，如海帶渣酸處理后（即酶解0 h）的糖濃度為6.2 mg/mL，高于其堿處理的2.9 mg/mL，這可能是由于酸、堿作用機理不同所致，酸性條件更適合分離海帶中的纖維素成分。實驗表明，海帶渣經(jīng)酸處理后得到了很好的降解，優(yōu)于其堿處理的效果。

圖3分別給出了酸、堿處理后的海帶渣和秸稈發(fā)酵過程中糖濃度和乙醇濃度變化情況。由圖3可以看出在發(fā)酵 22 h以后乙醇濃度和糖濃度基本不變，從發(fā)酵22 h產(chǎn)乙醇濃度看，相同條件下，海帶渣產(chǎn)乙醇濃度均明顯高于秸稈的，尤其是酸處理的海帶渣產(chǎn)乙醇濃度達到了 1.01%，高于其堿處理的0.74%，而秸稈酸、堿處理的產(chǎn)乙醇濃度接近，均低于 0.60%；從糖濃度變化情況看，海帶渣糖化液中的還原糖基本能被完全利用，如22 h堿處理的海帶渣中糖濃度僅為1.81 mg/mL，而經(jīng)酸、堿處理的秸稈發(fā)酵液中均有相當部分的糖不能被酵母利用，這可能是由于秸稈中半纖維素含量較高，降解了大量如木糖等不能被一般酵母利用的單糖。

實驗表明，與當前廣泛使用的玉米秸稈相比海帶渣更易降解產(chǎn)糖，且乙醇產(chǎn)率更高；特別是經(jīng)稀酸預處理后的海帶渣能很好的被纖維素酶降解，經(jīng)發(fā)酵得到較高濃度的乙醇，結(jié)合前期實驗，初步確立了海帶渣酸預處理方法。

2.3 兩種發(fā)酵方式的比較

在上述實驗的基礎上，將酸預處理后的海帶渣在相同條件下分別進行了同步糖化發(fā)酵和分步糖化發(fā)酵的實驗，結(jié)果如表2所示。可以看出在發(fā)酵22 h時，同步發(fā)酵乙醇濃度為10.2 g/L，高于分步發(fā)酵的8.7 g/L。因此，從乙醇產(chǎn)率上看同步發(fā)酵比分步發(fā)酵高17%以上；而且，同步發(fā)酵能更好的轉(zhuǎn)化利用糖，發(fā)酵液殘余糖濃度為3.5 mg/mL，低于分步的4.2 mg/mL。此外，作為當前常用的兩種基本發(fā)酵方式，同步糖化發(fā)酵具有簡化設備，節(jié)約總生產(chǎn)時間，并能克服葡萄糖對纖維素酶的反饋抑制作用等諸多優(yōu)點。綜上因素，海帶渣采用同步糖化發(fā)酵的方式生產(chǎn)乙醇比分步發(fā)酵法具有明顯優(yōu)勢。

2.4 低溫纖維素酶QP7復配降解效果

分別比較了在海帶渣同步發(fā)酵中，低溫QP7酶液、常溫纖維素酶單獨作用以及兩種酶混合作用下的效果（圖4）。在相同條件下， QP7酶組乙醇濃度為 0.32%，纖維素酶組乙醇濃度為 1.13%，均低于兩酶混合組的1.37%?？梢娫赒P7酶配合纖維素酶的作用下，產(chǎn)乙醇濃度提高21%以上。這可能是由于兩種酶復配降解時相互間具有某種協(xié)同作用所致。此外，在纖維素乙醇生產(chǎn)中，纖維素酶的成本占纖維素乙醇總成本的60%以上，而復配酶的利用在提高乙醇濃度的同時也降低了蒸餾的成本，綜合計算能夠顯著降低纖維素乙醇的生產(chǎn)成本，具有重要的應用前景。

表2 海帶渣兩種發(fā)酵方式的比較

在同步發(fā)酵中最大的問題是酵母的低溫發(fā)酵溫度與纖維素酶高酶解溫度之間的矛盾，而當前研究中大多是取二者的折中溫度，這既降低了纖維素酶的酶活，也影響了發(fā)酵效率[9-10]，而對低溫纖維素酶的研究正是解決這一問題的較好辦法之一。如本實驗中所用低溫QP7酶最適溫度為38 ℃左右，這與酵母發(fā)酵溫度基本適用，無疑具有重要的優(yōu)勢。本實驗中利用低溫QP7酶復配降解時效果明顯，但單獨使用時乙醇濃度偏低，因此在后續(xù)實驗中有必要對低溫QP7酶進行深入研究，以期提高其酶活及穩(wěn)定性等。

3 結(jié) 語

本實驗對海帶渣進行了纖維成分測定以及酶解發(fā)酵產(chǎn)乙醇的相關研究。結(jié)果表明，所用干海帶渣中纖維素含量達 28.3%，經(jīng)稀酸預處理的海帶渣酶解后還原糖濃度為31.1 mg/mL，經(jīng)酵母發(fā)酵后產(chǎn)乙醇濃度約1.01%L/L，均高于相同條件下的堿預處理；對海帶渣進行同步糖化發(fā)酵比對其進行分步糖化發(fā)酵乙醇產(chǎn)率高17%以上；在海帶渣同步糖化發(fā)酵中，添加南極低溫纖維素酶QP7與常溫纖維素酶進行復配降解時，乙醇產(chǎn)量提高21%以上，具有明顯的改良效果。通過實驗初步確立了海帶渣稀酸預處理方法和同步糖化發(fā)酵的方式，為進一步實驗作重要基礎。本實驗中單獨使用低溫QP7酶進行同步糖化發(fā)酵時乙醇產(chǎn)量偏低，后續(xù)實驗中有待進一步深入研究。

海帶類海藻植物在我國沿海的分布非常廣泛，目前我國海帶年產(chǎn)量占了全球年產(chǎn)量的 95%[2]；然而海帶工業(yè)生產(chǎn)中，以干物質(zhì)計，其利用率僅約30%，有逾50%的成分成為廢棄物[11]，這不僅浪費資源，也帶來環(huán)境的污染，因此對海帶渣等海藻工業(yè)廢棄物進行研究意義重大。相比陸生農(nóng)作物廢棄秸稈等，雖然對海帶渣等海藻工業(yè)廢棄物產(chǎn)燃料乙醇的相關研究起步較晚，報道不多，但意義同樣重大，應用前景廣闊。而且與秸稈等相比，由于結(jié)構(gòu)上的差異，海帶渣更易降解產(chǎn)糖。本實驗中對照樣玉米秸稈纖維素含量為 33.6%，高于海帶渣的28.3%，但相同條件下海帶渣降解更徹底，其降解產(chǎn)糖量和發(fā)酵產(chǎn)乙醇濃度均明顯高于秸稈。因此，將海帶渣作為產(chǎn)燃料乙醇原料具有獨特的優(yōu)勢和重要的意義。

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