周敬豪，徐存華，李玉嬋，黃順禮，熊珍愛，孫建華，蔣林斌，童張法，廖丹葵

（廣西大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，廣西 南寧 530004）

磁性微球是近 20年來發(fā)展起來的一種新型功能高分子材料，由于它同時具有無機磁性載體、超順磁響應(yīng)性以及表面功能化修飾等優(yōu)點[1]，在外磁場作用下可快速從反應(yīng)介質(zhì)中分離出來，因而在生物技術(shù)、化學(xué)、環(huán)境治理等領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用[2]。殼聚糖是具有很好生物相容性的天然多糖材料，其分子鏈上含大量的羥基和氨基可進(jìn)行修飾和功能化，因此廣泛用于酶的固定化[3-4]。

血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（angiotensin converting enzyme，ACE）是腎素-血管緊張素系統(tǒng)中的一種酶類，其在體內(nèi)不僅可以將血管緊張素Ⅰ轉(zhuǎn)化為血管緊張素Ⅱ，還會分解緩激肽，這都會導(dǎo)致人體內(nèi)血壓的升高。許多科研工作者通過篩選ACE抑制劑來尋找抗高血壓類物質(zhì)，但篩選ACE抑制劑需要大量的ACE[5]。商業(yè)ACE價格十分昂貴，從動物組織中提取ACE卻又存在過程繁瑣，產(chǎn)量極低，易失活等缺點。若將ACE固定在載體上，可以大大提高酶穩(wěn)定性和循環(huán)利用率。

洪韞嘉、劉宏等[5-6]以硫酸銨分級沉淀、透析平衡、親和分離等多步純化的高純度豬肺 ACE為原料，研究了殼聚糖和Sepharose CL-4B固定化ACE的性質(zhì)，但以豬肺二級沉淀粗提ACE為原料的固定化ACE尚無文獻(xiàn)報道，因此，本實驗擬以豬肺二級沉淀粗提ACE為原料，研究磁性殼聚糖固定化ACE的效果和固定化酶性質(zhì)，為簡化固定化酶的前處理提供依據(jù)。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

殼聚糖，脫乙酰度≥95%，浙江金殼生物化學(xué)有限公司；馬尿酰-組氨酰-亮氨酸（HHL），美國Sigma公司；環(huán)氧氯丙烷、三氟乙酸，分析純，中國國藥集團(tuán)；FeCl2·4H2O、FeCl3·6H2O、50%戊二醛、乙酸、氨水、Span-80、油酸等均為國產(chǎn)化學(xué)純。

SK8200HP數(shù)控超聲波清洗器（上海）；NICOLET 6700傅里葉變換紅外光譜儀（Thermo Fisher Scientific，美國）；Nano-S激光納米粒度分析儀（Malvern，英國）；STA 449 F3 Jupiter同步熱分析儀（NETZSCH，德國）；1260 液相色譜儀（Agilent，德國）；7400振動樣品磁強計（Lake Shore，美國）。

1.2 實驗方法

1.2.1 改性 Fe3O4磁性納米粒子及磁性殼聚糖微球的制備

采用化學(xué)共沉淀法制備Fe3O4磁性納米粒子[7]。配制一定濃度的 FeCl3·6H2O 和 FeCl2·4H2O 溶液，置于250 mL三口燒瓶中，通入氮氣，高速攪拌條件下滴加濃氨水，至溶液變成黑亮色，加入油酸改性，攪拌熟化30 min。反應(yīng)結(jié)束后，磁鐵分離收集，去離子水清洗干凈，真空干燥。

將殼聚糖溶于 2%的乙酸溶液中，加入 Fe3O4磁性納米粒子混合，超聲分散，高速攪拌條件下，緩慢將殼聚糖混合溶液滴加到裝有液體石蠟和Span-80的三口燒瓶中，攪拌30 min，加入交聯(lián)劑戊二醛，繼續(xù)攪拌1 h，調(diào)節(jié)pH值到9，攪拌1 h后結(jié)束反應(yīng)。產(chǎn)物依次用石油醚、乙醇、去離子水洗滌干凈，磁鐵分離收集，真空干燥并進(jìn)行表征[8]。

殼聚糖與戊二醛的交聯(lián)反應(yīng)及磁性殼聚糖微球的合成過程分別如圖1和圖2所示。

1.2.2 Fe3O4納米粒子及磁性殼聚糖微球的性能表征

樣品粒徑分布采用激光納米粒度分析儀進(jìn)行測定；結(jié)構(gòu)采用傅里葉變換紅外光譜儀進(jìn)行分析；磁學(xué)性能采用振動樣品磁強計進(jìn)行分析；熱失重過程采用同步熱分析儀進(jìn)行分析[9]。

1.2.3 血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（ACE）的固定化

從新鮮豬肺中提取二級沉淀 ACE粗酶[10]。稱取一定量磁性殼聚糖微球，加入環(huán)氧氯丙烷，在40℃條件恒溫水浴搖床中活化4 h。再稱取一定量活化后的磁性殼聚糖微球，按質(zhì)量體積比1∶10加入二級沉淀的ACE粗酶溶液（由含0.3 mol/L NaCl的0.1 mol/L硼酸鹽緩沖溶液配制，pH值8.3），在50 ℃恒溫水浴搖床中反應(yīng)1.5 h。反應(yīng)結(jié)束后，用去離子水和緩沖溶液洗滌固定化ACE的磁性殼聚糖微球，磁鐵分離收集。加入硼酸鹽緩沖溶液，4 ℃冰箱冷藏待用。

1.2.4 ACE活性測定方法

溶液酶活性測定[11]：以HHL作為酶反應(yīng)底物，酶反應(yīng)催化生成的馬尿酸（HA）作為檢測指標(biāo)。取20 μL ACE 酶液，加入 40 μL 底物溶液和 140 μL 緩沖液，在37 ℃下反應(yīng)30 min，加入25 μL 2 mol/L鹽酸終止反應(yīng)。反應(yīng)液用0.45 μm纖維膜過濾后進(jìn)液相檢測生成的HA的含量。1個酶活力單位（U）定義：在本實驗條件下，每分鐘催化底物 HHL生成1 μmol產(chǎn)物HA所需的酶量。

固定化酶活性測定：與測定溶液酶的方法相同，每次取30 mg固定化酶微球，加入40 μL底物溶液和160 μL緩沖液，在37 ℃下反應(yīng)30 min，4 ℃冷凍離心，取上清液加入25 μL鹽酸終止反應(yīng)，用0.45 μm纖維膜過濾后進(jìn)樣。固定化ACE活力單位（U）定義：在本實驗條件下，1 g固定化酶1 min催化底物HHL生成1 μmol產(chǎn)物HA為1個活力單位。

2 結(jié)果與討論

2.1 磁性殼聚糖微球結(jié)構(gòu)性能表征

2.1.1 粒度分析

粒徑分布是評價 Fe3O4磁性納米粒子和磁性殼聚糖微球的分散性和均一性的重要指標(biāo)。Fe3O4磁性納米粒子和磁性殼聚糖微球的粒徑分布如圖3和圖4所示。由圖3、圖4可知，F(xiàn)e3O4磁性納米粒子平均粒徑大約為6 nm，磁性殼聚糖微球的粒徑分布比較窄，平均粒徑大約為901 nm，具有良好的體表效應(yīng)，單位微球表面的活性基團(tuán)越多，可交聯(lián)結(jié)合的游離酶越多，因此可將磁性殼聚糖微球應(yīng)用于酶的固定化。

2.1.2 傅里葉紅外光譜（FT-IR）分析

圖5中a、b、c分別為Fe3O4納米粒子、殼聚糖及磁性殼聚糖微球的紅外光譜圖。其中，584 cm?1處為Fe3O4中Fe—O的特征吸收峰；3500 cm?1處強的吸收峰為—NH2中N—H鍵不對稱伸縮振動和對稱伸縮振動峰；3388 cm?1、3290 cm?1是O—H和N—H的伸縮振動峰； 2921 cm?1、2867 cm?1處為羧羥基和脂肪族碳?xì)涞纳炜s振動峰；1559 cm?1處為酰胺特征吸收峰；1400 cm?1左右為—CH2的彎曲振動、—CH3的變形振動峰；1062 cm?1處為C—O伸縮振動峰。譜線c為磁性殼聚糖微球的紅外譜圖，譜圖中不僅保留了殼聚糖原有的特征吸收峰，且在590 cm?1處出現(xiàn)了Fe3O4的Fe—O特征吸收峰，說明了制備的磁性殼聚糖微球包裹了Fe3O4磁性納米粒子。

2.1.3 磁響應(yīng)性分析

Fe3O4納米粒子和磁性殼聚糖微球的磁性分析結(jié)果如圖6。由圖6可知，F(xiàn)e3O4納米粒子和磁性殼聚糖微球均具有超順磁性，F(xiàn)e3O4納米粒子和磁性殼聚糖微球的飽和磁化強度分別為37.24 emu/g和7.93 emu/g，磁核包裹殼聚糖后，由于復(fù)合微球體積變大，磁性受到影響，但仍具有良好的磁響應(yīng)性，可用于后續(xù)的固定化酶的快速收集。

2.1.4 熱重分析

圖7為磁性殼聚糖微球熱重分析結(jié)果，從室溫升至120 ℃，其14%的失重應(yīng)為樣品中吸附水的脫除[12]。從120 ℃升溫到700 ℃，其 58%的失重為磁性微球中殼聚糖的熱分解及 Fe3O4骨架上 H、N的脫去。700 ℃后樣品質(zhì)量基本不變，由于 Fe3O4在N2氣保護(hù)下不會分解，因此可知磁性殼聚糖微球中Fe3O4的含量約為28%。

2.2 磁性殼聚糖微球固定化ACE條件優(yōu)化

2.2.1 固定化最適pH值的確定

從新鮮豬肺中提取二級沉淀物為ACE粗酶，按1.2.4節(jié)條件分析得ACE粗酶活性為0.048 U/mg。

取5組經(jīng)活化處理的磁性殼聚糖微球，分別加入5 mL pH值范圍從7.3～9.3 硼酸鹽緩沖液配制的ACE酶溶液，按1.2.3節(jié)條件對ACE進(jìn)行酶固定化，不同pH值條件下固定化酶活性結(jié)果見圖8。由圖8可知，固定化酶活性隨pH值升高先上升而后下降。當(dāng)pH值為8.3時，固定化酶活性最高，因此選取pH值 8.3進(jìn)行酶固定化。

2.2.2 固定化最適反應(yīng)溫度的確定

不同固定化溫度下固定化酶活性結(jié)果見圖 9。由圖9可知，固定化酶活性隨反應(yīng)溫度升高呈先上升而后下降。當(dāng)溫度為 50 ℃時，固定化酶活性最高，超過 50 ℃后，酶活性迅速下降，原因可能是酶活性部位因溫度升高而遭到破壞，導(dǎo)致固定化酶失活，活性下降，因此選取50 ℃為最適固定化溫度。

2.2.3 固定化最適反應(yīng)時間的確定

不同固定化時間下固定化酶活性結(jié)果見圖10。由圖10可知，隨反應(yīng)時間不斷增加，固定化酶活性增大。當(dāng)反應(yīng)超過1.5 h后，固定化酶活性開始下降，原因可能是此時微球負(fù)載酶量已達(dá)到飽和，延長反應(yīng)時間只會增大酶空間位阻而致使酶活性變小，因此選取1.5 h為最適固定化時間。

2.2.4 固定化最適蛋白濃度的確定

不同濃度 ACE酶液固定化酶的活性變化見圖11。由圖11可知，隨著粗酶液濃度增大，固定化酶活性也不斷增大。當(dāng)粗酶液濃度為6 mg/mL時，固定化酶活性達(dá)到最大。繼續(xù)增大粗酶液濃度，固定化酶活性反而呈微弱下降趨勢。這是因為磁性殼聚糖微球表面的活性基團(tuán)和酶的結(jié)合已趨于飽和，再增加酶液濃度，酶不但不和活性基團(tuán)結(jié)合，反而會使酶都聚集在一起，對酶活性中心造成阻礙，導(dǎo)致酶活性下降。因此，固定化的最適酶液濃度為 6 mg/mL，此時固定化酶活最大為0.048 U/g微球。

2.3 固定化酶性質(zhì)考察

2.3.1 pH值對酶活性的影響

相同酶活力的游離ACE和固定化ACE在不同pH值條件下酶活變化如圖12所示。由圖12可知，雖然固定化酶和游離酶在pH值7.8處都具有最高的活力，但固定化酶的適合pH值范圍要寬于游離酶，可能是固定化后ACE的構(gòu)象發(fā)生了改變，因此在較寬的pH值范圍內(nèi)較為穩(wěn)定。

2.3.2 溫度對酶活性的影響

相同活力游離ACE和固定化ACE在不同溫度下酶活變化如圖13。由圖13可知，游離酶在42 ℃時具有最高酶活力，繼續(xù)升高溫度，酶活力快速下降；而固定化酶在 47 ℃時具有最大酶活力，說明酶固定化后提高了熱穩(wěn)定性，其適用范圍較游離酶更寬。

2.3.3 固定化酶的操作穩(wěn)定性

重復(fù)使用性是固定化酶在應(yīng)用方面的一個重要指標(biāo)。使用磁性殼聚糖固定化酶連續(xù)測定酶活力10次，結(jié)果見圖14。從圖14可知，固定化酶使用10次后，其相對活力仍然保持在40%以上，顯示出較高的操作穩(wěn)定性。

2.3.4 固定化酶的儲藏穩(wěn)定性

將固定化酶置于pH值8.3硼酸緩沖液，4 ℃冰箱中保存30天后，其活力為初始酶活力的82%，這表明固定化酶具有良好的儲藏穩(wěn)定性。

本實驗采用豬肺二次鹽析沉淀的粗酶為原料進(jìn)行固定化，操作簡便，省略了透析、凝膠層析、離子交換等多步分離純化過程，除固定化酶活比文獻(xiàn)[5]報道的0.085 U/g偏低外，固定化酶的其它性質(zhì)均與文獻(xiàn)報道相近，同時，由于采用磁性微球為固定化載體，該固定化酶在使用過程中進(jìn)行分離較其它的固定化載體更為方便和快速。

3 結(jié) 論

（1）采用乳化交聯(lián)法制備了磁性殼聚糖微球，并對磁核和磁性殼聚糖微球結(jié)構(gòu)進(jìn)行了表征。結(jié)果表明，磁性微球平均粒徑為901 nm，具有良好的磁響應(yīng)性和超順磁性。

（2）以磁性殼聚糖微球作為固定化載體，對粗提血管緊張素轉(zhuǎn)化酶進(jìn)行固定化，并對固定化條件進(jìn)行了優(yōu)化，得到固定化ACE的最佳條件為：pH值 8.3，溫度為50 ℃，反應(yīng)1.5 h，酶液蛋白濃度為 6 mg/mL，此時固定化酶活力最高為 0.048 U/g微球。

（3）對磁性殼聚糖微球固定化酶進(jìn)行性質(zhì)研究，實驗結(jié)果表明，與游離酶相比，固定化酶 pH值穩(wěn)定性、熱穩(wěn)定性均得到提高。固定化酶具有較好的重復(fù)使用性和儲藏穩(wěn)定性。

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