趙紅蓮， 林 健， 趙 楊， 邢恩鴻， 金小平， 申興斌

(承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院， 河北 承德 067000)

食管癌(esophageal carcinoma)是消化道常見的惡性腫瘤，死亡率高。我國(guó)EC的病理組織類型主要是鱗狀細(xì)胞癌，約占食管總發(fā)病率的83%［1］。食管癌的發(fā)生發(fā)展受多種因子的調(diào)控與維持。很多研究發(fā)現(xiàn)，基質(zhì)蛋白酶2(MMP－2)及其抑制劑TIMP－2的高表達(dá)在腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移過(guò)程中起著重要作用［2，3］。本研究運(yùn)用免疫組化法檢測(cè)了50例食管鱗癌組織中MMP－2、TIMP－2的表達(dá)情況及其相關(guān)性，探討其在食管鱗癌的浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移中所起的作用，為食管鱗癌的診斷、治療及預(yù)后判斷提供新的理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料:收集我院50例食管鱗癌患者中男性47例，女3例。年齡45－78歲，平均年齡56歲。病理學(xué)分級(jí);其中高中分化36例，低分化14例;按浸潤(rùn)程度不同分為≤肌層組織9例，＞全層41例。有淋巴轉(zhuǎn)移組27例，無(wú)淋巴轉(zhuǎn)移組23例。所有病人術(shù)前均未接受放化療治療;同時(shí)取距上述癌組織邊緣大于5cm處的正常粘膜20例標(biāo)本作為對(duì)照。

1.2 主要試劑:兔抗人MMP－2多克隆抗體(北京中杉金橋);兔抗人TIMP－2多克隆抗體(武漢博士德公司);即用型DAB顯色試劑盒(購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司DAB－0031)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法:石蠟切片(5微米)，電熱恒溫箱80℃烘烤50min，二甲苯脫蠟至水。3%過(guò)氧化氫室溫孵育10min。蒸餾水沖洗，PBS浸泡5min，在微波爐里加熱0.01 moL/L枸櫞酸鈉緩沖液(pH6.0)至沸騰后將上述組織切片放入，抗原熱修復(fù)15min，室溫放置 40min，PBS沖洗 3次，每次5min。滴加 Ι抗50μL(MMP－2 1:80工作液;TIMP－2 1:100工作液)，4℃冰箱過(guò)夜。PBS洗3次每次5min。滴加Ⅱ抗(快捷型酶標(biāo)羊抗鼠/兔Ig G聚合物)，室溫孵育15min。PBS洗3次，每次5min。DAB顯色5min，蘇木素復(fù)染，透明、封片、鏡檢。

1.4 免疫組化結(jié)果判斷:MMP－2、TIMP－2主要定位于細(xì)胞質(zhì)，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕黃色或棕褐色顆粒為陽(yáng)性細(xì)胞。采用陽(yáng)性染色強(qiáng)度結(jié)合陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比進(jìn)行判斷。在400倍視野下，每張切片隨機(jī)觀察4個(gè)視野，將切片中平均陽(yáng)性比例及染色深淺分別計(jì)0－3分，切片中無(wú)陽(yáng)性細(xì)胞0分，陽(yáng)性細(xì)胞＜25%計(jì)1分，26－50%計(jì)2分，51－75%計(jì)3分，＞75%計(jì)4分;染色強(qiáng)度以多數(shù)細(xì)胞為準(zhǔn);無(wú)著色計(jì)0分，淡黃色計(jì)1分，黃或深黃色計(jì)2分，褐或棕褐色計(jì)3分，再按這兩項(xiàng)指標(biāo)的積分相加將結(jié)果分為4級(jí):0分為“－”，1－2分為“+”，3－4分為“++”，5－6分為“+++”，其中“++”“+++”為強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:實(shí)驗(yàn)資料的統(tǒng)計(jì)學(xué)處理通過(guò)SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件完成，等級(jí)資料采用秩和檢驗(yàn)(Wilcixon signed ranks text，Kruskal Wallis text)，以 P＜0.05為差異有顯著性。采用Spearman等級(jí)相關(guān)分析MMP－2、TIMP－2的相關(guān)性。

2 結(jié)果

圖1 正常食管粘膜(HE×200)

圖2 食管鱗癌(HE×200)

2.1 免疫組化結(jié)果

2.1.1 MMP－2、TIMP－2在食管鱗癌和食管正常粘膜中的表達(dá):MMP－2在20例正常食管粘膜與50例食管鱗癌中其強(qiáng)陽(yáng)性、中等陽(yáng)性及弱陽(yáng)性表達(dá)分別為17例、16例、12例，5例陰性，兩組比較表達(dá)強(qiáng)度有顯著差異(P＜0.01)。TIMP－2在正常食管粘膜中部分免疫反應(yīng)呈弱陽(yáng)性信號(hào)，在食管鱗癌組織中有8例強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，10例中等陽(yáng)性表達(dá)，21例弱陽(yáng)性表達(dá)。TIMP－2在兩組中的表達(dá)強(qiáng)度有差異(P＜0.01)。

2.1.2 食管鱗癌中MMP－2、TIMP－2與臨床病理參數(shù)的關(guān)系:MMP－2在食管鱗癌的表達(dá)與浸潤(rùn)深度、有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期有關(guān)，與患者的年齡、性別、腫瘤大小、腫瘤分化程度無(wú)關(guān)。在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的26例食管癌組織和無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的24例食管鱗癌標(biāo)本中，MMP－2的強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)分別是11例和6例，兩組陽(yáng)性表達(dá)比較有顯著差異(P＜0.05)。在9例浸潤(rùn)≤肌層組和41例浸潤(rùn)＞肌層組MMP－2強(qiáng)陽(yáng)性及中等陽(yáng)性表達(dá)分別是16例、15例和1例、1例，兩組陽(yáng)性表達(dá)比較有顯著差異(P＜0.05)。TNM分期Ⅰ+Ⅱ期26例與Ⅲ+Ⅳ期24例強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)為5例和11例，兩組比較也有顯著差異(P＜0.05)。MMP－2在不同性別、年齡(＜60歲，≥60歲)、腫瘤組織分化程度分組中的表達(dá)無(wú)明顯差異 (P ＞0.05，P ＞0.05，P ＞0.05)。

TIMP－2在食管鱗癌的表達(dá)與浸潤(rùn)深度、有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期有關(guān)，與患者的年齡、性別、腫瘤大小、腫瘤分化程度無(wú)關(guān)。在26例有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和24例無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的食管鱗癌標(biāo)本中，TIMP－2的陽(yáng)性表達(dá)數(shù)分別是23例和16例，兩組陽(yáng)性表達(dá)數(shù)比較有顯著差異性(P＜0.05)。在9例浸潤(rùn)≤肌層組和41例浸潤(rùn)＞肌層組，TIMP－2強(qiáng)陽(yáng)性及中等陽(yáng)性表達(dá)分別為8例、10例和0例、1例，兩組比較差異有顯著性(P＜0.05)。在TNM分期Ⅰ+Ⅱ期26例與Ⅲ+Ⅳ期24例食管癌標(biāo)本中，Ⅰ+Ⅱ期8例陰性，13例弱陽(yáng)性，Ⅲ+Ⅳ期3例陰性，8例中等陽(yáng)性，5例強(qiáng)陽(yáng)性，兩組比較也有顯著差異(P＜0.05)。TIMP－2在不同性別、年齡(＜60歲，≥60歲)、腫瘤組織分化程度分組中的表達(dá)無(wú)明顯差異 (P＞0.05，P ＞0.05，P ＞0.05)。

2.1.3 MMP－2、TIMP－2在食管鱗癌中表達(dá)的相關(guān)性分析:對(duì)MMP－2、TIMP－2在食管鱗癌中的表達(dá)情況，采用spearman等級(jí)相關(guān)分析。MMP－2和TIMP－2相關(guān)系數(shù)r=0.51;P＜0.01，表明他們之間有明顯相關(guān)性。

表1 MMP－2在食管正常粘膜和食管鱗癌中的表達(dá)

表2 TIMP－2在食管正常粘膜和食管鱗癌中的表達(dá)

表3 食管鱗癌中MMP－2與臨床病理參數(shù)的關(guān)系

*P ＜0.05

表4 食管鱗癌中TIMP－2與臨床病理參數(shù)的關(guān)系

3 討論

食管癌是當(dāng)今世界導(dǎo)致人類死亡的主要惡性腫瘤之一，它的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)多階段多因素的過(guò)程。目前認(rèn)為食管癌患者的預(yù)后受多種因素影響，隨著基因研究的興起，分子生物學(xué)指標(biāo)對(duì)預(yù)后的影響是目前研究的熱點(diǎn)。

基質(zhì)金屬蛋白酶MMPs是一個(gè)降解細(xì)胞外基質(zhì)的酶家族，其功能活性受組織抑制物抑制?；|(zhì)金屬蛋白酶抑制劑TIMPs是MMPs的抑制劑，與MMPs共同參與ECM合成和降解。MMP－2具有降解多種ECM成分的強(qiáng)大能力，TIMP－2能特異性與MMP－2催化中心的鋅離子結(jié)合，而封閉等催化中心，從而使MMP－2失去降解ECM的活性。MMP－2/TIMP－2表達(dá)失衡是引起ECM異常積聚的重要因素之一［4］。

研究表明，腫瘤中MMPS和TIMPS之間平衡失調(diào)，是腫瘤進(jìn)展的一個(gè)重要因素［5］。近來(lái)基因調(diào)控的實(shí)驗(yàn)也進(jìn)一步證實(shí)了MMP－2、TIMP－2失衡在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的重要作用。本研究表明，MMP－2與TIMP－2在食管鱗癌中的表達(dá)明顯高于正常食管組織，同時(shí)，在浸潤(rùn)超過(guò)肌層、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期Ⅲ+Ⅳ期的食管鱗癌組織中明顯高于浸潤(rùn)未超過(guò)肌層、無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期Ⅰ+Ⅱ期的食管鱗癌組織，說(shuō)明MMP－2與TIMP－2在食管鱗癌的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中也起著非常重要的作用。

本研究應(yīng)用免疫組化技術(shù)檢測(cè)MMP－2、TIMP－2在食管鱗癌及正常食管粘膜中的表達(dá)情況。結(jié)果表明，50例食管鱗癌組織中MMP－2、TIMP－2的陽(yáng)性表達(dá)例數(shù)分別是45例和39例，而在正常食管粘膜中的陽(yáng)性數(shù)僅為7例和5例，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，與食管正常粘膜相比，MMP－2、TIMP－2在食管鱗癌組織中存在高表達(dá)(p＜0.01，P ＜0.01)。

本研究為了探討MMP－2、TIMP－2在食管鱗癌發(fā)生發(fā)展之間的關(guān)系，檢測(cè)MMP－2、TIMP－2在食管鱗癌中的表達(dá)情況，從而判斷MMP－2、TIMP－2是否可能成為食管鱗癌診斷、治療及預(yù)后的理想分子靶標(biāo)。本研究分析了不同年齡、不同性別、不同分期、不同分化程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況不同的食管鱗癌中MMP－2、TIMP－2的表達(dá)情況，旨在探討MMP－2、TIMP－2與食管鱗癌的上述臨床特征之間的相關(guān)性，以便較好地了解食管鱗癌從早期向晚期演變過(guò)程中MMP－2、TIMP－2的變化情況。免疫組化檢測(cè)結(jié)果表明MMP－2、TIMP－2在浸潤(rùn)程度深、臨床分期晚、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的組織中的表達(dá)明顯高于浸潤(rùn)程度淺、臨床分期早、無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的組織。表明MMP－2、TIMP－2的表達(dá)與食管鱗癌的轉(zhuǎn)化過(guò)程以及腫瘤細(xì)胞的侵襲有關(guān)。

本研究中MMP－2與TIMP－2在食管鱗癌浸潤(rùn)超過(guò)肌層組、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組、TNMⅢ+Ⅳ期組的表達(dá)均高于浸潤(rùn)未超過(guò)肌層組、無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組、TNMⅠ+Ⅱ期組，但相對(duì)于MMP－2陽(yáng)性表達(dá)的增高TIMP－2陽(yáng)性表達(dá)增高的幅度較小，從而導(dǎo)致MMP－2、TIMP－2比例失衡，同時(shí)也提示MMP－2與TIMP－2表達(dá)比例的失衡與食管鱗癌的浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移有關(guān)。

［1］孫秀娣，牧人，周有尚，等.中國(guó)胃癌死亡率20年變化情況分析及其發(fā)展趨勢(shì)預(yù)測(cè)［J］.中華腫瘤雜志，2004，26(1):429 －435.

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