蒲春霞，何海蓉

(成都大學(xué)醫(yī)護(hù)學(xué)院，四川成都，610106)

黃褐斑是一種多因素、多系統(tǒng)、多環(huán)節(jié)所致的色素性皮膚病，發(fā)病機(jī)理復(fù)雜，真正的發(fā)病原因目前尚不十分清楚，也無療效確切的中、西醫(yī)治療方案［1，2］。其作為一種色素增加性皮膚病，控制黑素生成是其治療的根本。黑素細(xì)胞合成黑素是一個(gè)非常復(fù)雜的過程，受到多種因素的影響。筆者根據(jù)黃褐斑的發(fā)生與內(nèi)分泌紊亂有關(guān)及目前學(xué)術(shù)界通行的“雌激素和黃體酮增多進(jìn)而刺激黑色素細(xì)胞而致色素沉著”的發(fā)病學(xué)假說［3］，用黃體酮注射液(孕激素)攻擊雌性大鼠，復(fù)制黃褐斑動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，以期為探索其發(fā)病機(jī)制和治療方案提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1．1 動(dòng)物和試劑

SD大鼠，普通級(jí)，20只，體重220．6～250．0 g，雌性。供應(yīng)單位:成都中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK(川)2008-11，質(zhì)量合格證號(hào):NO．0006174。黃體酮注射液，規(guī)格:1 mL:20 mg，批號(hào):091101，浙江仙琚制藥股份有限公司生產(chǎn)，試驗(yàn)時(shí)無需配制。超氧化物歧化酶(SOD)測試盒，批號(hào):20100312，丙二醛(MDA)測定試劑盒，批號(hào):20100408，南京建成生物工程研究所第一分所生產(chǎn)。酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)品，規(guī)格:100 mg/支，批號(hào):140609-200711，中國藥品生物制品檢定所出品。TP總蛋白測定試劑盒(雙縮脲法)，規(guī)格:6*50 mL，批號(hào):1209071，四川省邁克科技有限責(zé)任公司生產(chǎn)。

1．2 儀器設(shè)備

DW-40L188型低溫保存箱(－40℃)，青島海爾科技有限公司;島津LC-2010AHT高效液相色譜儀;日本TMS-1024I型全自動(dòng)生化分析儀，日本東京貿(mào)易醫(yī)療系統(tǒng)株式會(huì)社生產(chǎn)。

1．3 實(shí)驗(yàn)方法

雌性大鼠20只，按體重隨機(jī)分為正常組、模型組，每組10只動(dòng)物。模型組每日于大鼠后腿根部以7．5 mg/kg(相當(dāng)于人用臨床劑量的3倍)肌肉注射20 g/L黃體酮注射液1次，正常組注射等體積注射用水，連續(xù)注射30 d。

1．4 觀察指標(biāo)和檢測方法

1．4．1 血液流變性測定 末次給藥后次日，大鼠腹腔注射30 mg/kg戊巴比妥鈉麻醉后，腹主動(dòng)脈取血3 mL，肝素(80×103 u/L)抗凝，測定血液流變性各指標(biāo)。

1．4．2 肝臟、皮膚組織中酪氨酸含量測定 試驗(yàn)大鼠取血后處死，取背部皮膚(脫毛)及肝臟各1塊，用預(yù)冷生理鹽水(4℃)沖洗，除凈雜質(zhì)，濾紙拭干，切取皮膚、肝臟各0．5 g，分別放入盛有2．0 mL預(yù)冷生理鹽水的小燒杯內(nèi)，剪碎后勻漿，勻漿液3 500 r/min離心15 min，取上清液在全自動(dòng)生化儀上測定勻漿液總蛋白含量，用于計(jì)算每克組織中各指標(biāo)含量或活性。

1．4．3 肝臟、皮膚組織中MDA含量和SOD活性測定 取上述勻漿上清液按說明書操作，采用試劑盒檢測肝臟及皮膚中MDA，SOD。按說明書公式計(jì)算MDA含量及SOD活力。

1．4．4 皮膚黑色素細(xì)胞的病理形態(tài)學(xué)檢查 末次造模給藥24 h后，麻醉、腹主動(dòng)脈取血處死大鼠，取大鼠背部去毛皮膚1塊，Bouin液固定。常規(guī)石蠟包埋切片，片厚4 μm，載玻片經(jīng)防脫處理后撈片、烘片。再經(jīng)常規(guī)脫蠟至水，PBS水洗，以H2O2質(zhì)量濃度為30 g/L的H2O2溶液封閉，用鼠抗人單克隆抗體HMB45(mdantmaa黑素瘤)為第一抗體，以ElivisionTMplus免疫組化方法顯示表皮中的黑色素顆粒，蘇木素染色，中性樹膠封片。光學(xué)顯微鏡觀察黑色素細(xì)胞在表皮中的分布及分泌功能情況，黑色素陽性目標(biāo)用計(jì)算機(jī)進(jìn)行圖象分析。在奧林巴斯BX41-32P02顯微鏡100倍窗口下，每片觀察5個(gè)不同視野，找到陽性目標(biāo)(表皮和附件上皮細(xì)胞胞漿中出現(xiàn)棕色反應(yīng))并拍照后，用成都泰盟科技有限公司生產(chǎn)的BI-2000型圖像分析系統(tǒng)對(duì)目標(biāo)圖象進(jìn)行定量分析，計(jì)算其積分光密度、平均光密度、平均灰度、目標(biāo)面積和分布密度。

1．5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)處理

對(duì)皮膚及肝臟中的酪氨酸，MDA，SOD含量及皮膚黑色素細(xì)胞的積分光密度、平均光密度、平均灰度和目標(biāo)面積進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，符合正態(tài)性檢驗(yàn)則進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，然后選擇t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，不符合正態(tài)性檢驗(yàn)則采用非參數(shù)檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

2 結(jié)果與分析

大鼠造模后，全血粘度均有明顯升高(P＜0．05)，其余指標(biāo)除血漿粘度和紅細(xì)胞壓積外，也均有不同程度的升高，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(表1)。模型組大鼠組織酪氨酸含量均明顯升高(P＜0．05)(表2)。模型組大鼠肝臟SOD活力明顯降低(P＜0．05)，皮膚MDA含量明顯升高(P＜0．05)(表3)。大鼠黑色素細(xì)胞染色深淺度用灰度值和光密度值表示，顏色越深，灰度值越小，光密度值越大。積分光密度是平均光密度與面積的乘積，顏色越深，面積越大，積分光密度越高。造模后大鼠黑色素細(xì)胞平均灰度值明顯低于正常組，統(tǒng)計(jì)學(xué)有極顯著差異(p＜0．001)，平均光密度值、積分光密度值、目標(biāo)面積和分布密度均明顯高于正常組，統(tǒng)計(jì)學(xué)有極顯著差異(p＜0．001)(表4)。

表1 黃體酮致黃褐斑模型大鼠血液流變性影響(x±SD)

3 結(jié)論與討論

黃褐斑作為彌漫性過度色素沉著，常伴內(nèi)分泌失調(diào)，在垂體分泌促腎上腺皮質(zhì)激素時(shí)，也分泌過量的黑色素細(xì)胞刺激素，因而皮膚黑色加深。黑色素過多的原因之一是由于皮膚黑色素產(chǎn)生過多，而酪氨酸酶在黑色素生物合成過程中起著極為重要的作用。酪氨酸酶是黑色素代謝中的關(guān)鍵酶，它可直接影響黑色素的合成［4，5］。其次，氧化與抗氧化失衡可能是產(chǎn)生黃褐斑的重要因素。氧自由基與皮膚黑色素的形成及色素沉著有關(guān)［6，7］。MDA可導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子發(fā)生交聯(lián)，形成熒光發(fā)色團(tuán)色素。SOD除能有效清除自由基外，還具有抑制酪氨酸酶的活性，降低色素沉著的作用。大量資料表明，黃褐斑患者血中SOD和過氧化氫酶(CAT)活性顯著降低，LPO和MDA含量明顯增高。本研究表明，模型組大鼠組織酪氨酸含量均明顯升高;大鼠肝臟SOD活力明顯降低，皮膚MDA含量明顯升高，符合黃褐斑生物化學(xué)改變特征。

表2 黃體酮致黃褐斑模型大鼠組織中酷氨酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)(x±SD) mg·g－1

表3 黃體酮致黃褐斑模型大鼠組織中MDA和SOD含量(x±SD)

表4 黃體酮致黃褐斑模型大鼠黑色素細(xì)胞的變化(x±SD)

黃褐斑作為全身性疾病的局部反應(yīng)，臨床資料研究表明黃褐斑患者存在血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)異常，認(rèn)為血液流變學(xué)改變與黃褐斑關(guān)系密切［8］。本次研究檢測了血液流變學(xué)指標(biāo)來考察模型是否成功。大鼠造模后全血粘度均有明顯升高，其余指標(biāo)除血漿粘度和紅細(xì)胞壓積外，也均有不同程度的升高，表明該模型與臨床研究結(jié)果一致。

判斷黃褐斑動(dòng)物模型是否成功最直接、客觀的指標(biāo)，是皮膚病理學(xué)檢查黑色素沉著是否增多。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型組黑色素細(xì)胞較正常組明顯增多，呈強(qiáng)陽性反應(yīng)。計(jì)算機(jī)病理圖象學(xué)定量分析結(jié)果，模型組黑色素著色面積、黑色素細(xì)胞數(shù)明顯大于正常組，黑色素著色深度也明顯增加，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理有顯著性差異。說明造模后大鼠表皮黑色素著色面積、深度明顯加大。

綜上所述，筆者認(rèn)為用黃體酮注射大鼠復(fù)制的黃褐斑模型在臨床研究資料、生物化學(xué)、病理學(xué)指標(biāo)方面均可靠。黃體酮刺激造成的機(jī)體內(nèi)分泌紊亂不僅使合成黑色素的酪氨酸酶含量增加，它還可能使機(jī)體抗氧化能力降低，從而進(jìn)一步增加酪氨酸酶含量，增加黑色素的生成。本次研究針對(duì)目前治療黃褐斑無確切有效的中西醫(yī)療法，建立了可靠的動(dòng)物模型。

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