張麗佳，薛 銀，張岑容，胡松華

(浙江大學動物科學學院動物醫(yī)學系，杭州 310058)

奶牛子宮內膜炎多數(shù)是由產(chǎn)后子宮感染細菌引起的一種炎癥反應，該病可造成奶牛妊娠推遲，繁殖率下降，甚至不孕［1］。據(jù)報道，從患病奶牛子宮內分離到的細菌主要有葡萄球菌、鏈球菌、大腸桿菌、棒狀桿菌、糞腸球菌、芽孢桿菌、變形桿菌、克雷伯氏菌、沙門氏桿菌等［1－3］。奶牛子宮內膜炎常用在子宮內灌注抗菌藥物的方法進行治療。抗生素治療的一個直接后果是造成牛奶中藥物殘留，危害食品衛(wèi)生［4－5］。為了減免抗生素對牛奶的污染，我國一些奶牛場采用中草藥或其提取物防治奶牛子宮內膜炎，其中以桉油精及其制劑比較常見。桉油精為一種味似樟腦的無色液體，屬單萜類化合物，主要存在于桉葉、迷迭香、番石榴等植物揮發(fā)油中［6］，具有抗菌、抗炎、殺蟲、鎮(zhèn)痛、促進透皮吸收等作用［7－9］。桉油精可作為皮膚滲透增強劑、鼻血管收縮劑、鎮(zhèn)咳劑、消毒劑、殺蟲劑、芳香劑等應用于醫(yī)藥、工業(yè)、香料行業(yè)中［10－11］。由于奶牛子宮內膜炎主要是由細菌感染引起的一種炎癥反應，在治療時需考慮殺滅病原和促進炎癥消散兩個方面。本文研究了桉油精對37株子宮內膜炎臨床分離菌株的體外抗菌作用及其對人工致炎癥作用的影響，為臨床上采用桉油精治療奶牛子宮內膜炎提供實驗依據(jù)。

1 材料

1．1 藥品 桉油精，浙江金大康動物保健有限公司產(chǎn)品，批號20120409;地塞米松磷酸鈉注射液，河南龍源藥業(yè)股份有限公司，批號11083001。

1．2 細菌 在2010～2011年期間從奶牛子宮內膜炎病例分離到的分離株，其中大腸桿菌9株、金黃色葡萄球菌8株、凝固酶陰性葡萄球菌(CNS)6株、停乳鏈球菌4株、無乳鏈球菌4株、乳房鏈球菌4株、沙門氏菌2株。以上細菌保存于浙江大學動物科學學院中獸醫(yī)實驗室。

1．3 實驗動物 ICR小鼠，清潔級，體重25～30 g，雄性，購自上海西普爾－必凱實驗動物有限公司。

1．4 試劑及儀器 MH肉湯、MH瓊脂，杭州微生物試劑有限公司;依文思蘭(Evans blue)，F(xiàn)luka進口分裝，上海化學試劑采購供應站經(jīng)銷;吐溫－80，浙江省溫州清明化工有限公司;瓊脂粉、二甲苯，國藥集團化學試劑有限公司;恒溫培養(yǎng)搖床，QYC－200型，上海?，攲嶒炘O備有限公司;立式壓力蒸汽滅菌器，LS－B50L型，上海華線醫(yī)用核子儀器有限公司;潔凈工作臺，上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠;酶標儀，Multiskan，MK3，美國 Thermo 公司;獨立送風飼養(yǎng)籠具，IVC－II型，蘇州市馮氏實驗動物設備有限公司。

2 方法

2．1 抗菌作用研究

2．1．1 細菌培養(yǎng) 將上述7種細菌分別接種于MH肉湯中，37℃孵育6～8 h。用生理鹽水校正濃度至0．5麥氏比濁標準，約含1×108CFU/mL。

2．1．2 最小抑菌濃度(MIC)測定 參照文獻［12］，取試管12支，編號。第1管中加入MH肉湯1．6 mL，2～10管每管加入1 mL，再在第1管加入桉油精0．4 mL(372 mg)混勻，然后吸取1 mL至第2管，混勻后再吸取1 mL至第3管，如此連續(xù)倍比稀釋至第10管;1～10管分別加入菌液10μL，使每管的菌液濃度為1×106CFU/mL;第11號管加入MH肉湯2 mL和菌液10μL作為陽性對照;第12管加入MH肉湯2 mL和桉油精10μL作為陰性對照。將接種后的試管置于37℃培養(yǎng)24 h后觀察結果，以肉眼未見細菌生長的最低藥物濃度為受試菌的MIC。

2．1．3 最低殺菌濃度(MBC)測定 參照文獻［13］，從以上未見細菌生長的試管中每管取100μL接種于MH瓊脂平板，涂布均勻，37℃培養(yǎng)24 h后觀察結果，以未見細菌生長的最低含藥濃度為MBC。

2．2 抗炎作用研究

2．2．1 小鼠耳腫脹實驗 參照文獻［14］，取雄性ICR小鼠40只，稱重，體重25～30 g，隨機分成5組:三個桉油精處理組，用2%吐溫－80稀釋桉油精，得濃度為100、200、400 mg/mL三種溶液，按照100、200、400 mg/kg三種劑量灌胃給藥;陽性藥物對照組腹腔注射給藥(地塞米松，5 mg/kg);空白對照組2%吐溫－80灌胃給藥(10 mL/kg)。各組動物連續(xù)給藥3 d，每天1次。末次給藥0．5 h后，取二甲苯20μL/只涂布于小鼠右耳前后兩面，每面各10μL，左耳不作處理;0．5 h后，沿耳廓剪下雙耳，用9 mm直徑打孔器在兩耳相同部位打孔，稱重，并計算腫脹度、腫脹抑制率及耳增重百分比。腫脹度=右耳片重－左耳片重，腫脹抑制率=(空白組腫脹度－給藥組腫脹度)/對照組腫脹度，耳增重百分比=耳腫脹度/左耳重×100%。

2．2．2 小鼠腹腔毛細血管通透性實驗 參照文獻［15］，取雄性ICR小鼠24只，稱重，體重25～30 g，隨機分成4組:桉油精組(200 mg/kg)、桉油精組(400 mg/kg)、陽性組(地塞米松:5 mg/kg)以及空白組(2%吐溫－80);給藥方式同2．2．1項。末次給藥45 min后小鼠尾靜脈注射0．5%依文思蘭0．1 mL/10 g，同 時 立 即 腹 腔 注 射 0．6% 醋 酸0．2 mL/只;30 min后處死并用5 mL生理鹽水沖洗腹腔，收集腹腔液，3500 r/min離心5 min;取上清，測定OD630。

2．2．3 統(tǒng)計分析 實驗數(shù)據(jù)表示為平均值±標準差(x±s)，采用 SPSS(11．5)統(tǒng)計軟件中 One－Way ANOVA方差分析，比較不同組之間數(shù)據(jù)的差異性，P＜0．05，即判定為差異性顯著。

3 結果與分析

3．1 桉油精的抗菌作用 桉油精對37株供試菌的最小抑菌濃度及最低殺菌濃度結果見表1。桉油精對7種細菌均有一定的抗菌作用，其中對大腸桿菌的抗菌作用最明顯，MIC和 MBC分別為3．9、6．0 mg/mL;對金黃色葡萄球菌的抗菌作用最弱，MIC 和 MBC 分別為12．4、18．2 mg/mL。綜合比較7種細菌的抗菌作用，桉油精的抗菌活性由強到弱分別為:大腸桿菌、乳房鏈球菌、沙門氏桿菌、無乳鏈球菌、CNS、停乳鏈球菌、金黃色葡萄球菌。

表1 桉油精對奶牛子宮內膜炎分離菌的最小抑菌濃度(M IC)和最低殺菌濃度(MBC) mg/m L

3．2 桉油精對二甲苯所致小鼠耳腫脹的影響 結果見表2。給藥組小鼠耳腫脹程度顯著低于空白組，桉油精中、高劑量組及地塞米松陽性藥物組的腫脹度極顯著低于空白對照組;二甲苯引起各組小鼠耳腫脹的程度由高到低依次為空白對照組＞100 mg/kg桉油精組＞200 mg/kg桉油精組＞地塞米松組＞400 mg/kg桉油精組。

表2 桉油精對二甲苯所致小鼠耳腫脹度、腫脹抑制率及耳增重百分比

3．3 桉油精對小鼠腹腔毛細血管通透性的影響由表3可見，桉油精和地塞米松可抑制依文思蘭染料滲出，與空白組比較，400 mg/kg桉油精組及地塞米松陽性藥物組可顯著性抑制染料滲出。

表3 桉油精對小鼠腹腔毛細血管通透性的影響

4 討論

桉油精屬單萜類化合物，主要存在于桉葉、迷迭香、番石榴等植物的揮發(fā)油中，尤以桉葉油含量最多，可達70%以上。Oyedeji等［7］研究發(fā)現(xiàn)，生長在尼日利亞的赤桉油、柳桉油、白桉油、剝桉油對革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌均有抑制效果，它們在5 mg/mL的濃度下都有一定的抑菌活性;Ponce等［6］采用瓊脂擴散法研究了藍桉油的抗菌活性，表明其最小殺菌濃度為0．93～15μL/mL。本文選取臨床上分離的7種奶牛子宮內膜炎主要致病菌研究桉油精的抗菌活性，結果顯示，桉油精對7種細菌均有抑制作用，抗菌活性由強到弱分別為:大腸桿菌、乳房鏈球菌、沙門氏桿菌、無乳鏈球菌、CNS、停乳鏈球菌、金黃色葡萄球菌，平均 MIC為3．9～12．4 mg/mL，平均 MBC 為 6．0 ～18．2 mg/mL，與文獻報道［6］基本一致。

奶牛子宮內膜炎是臨床上常見的奶牛疾病之一，是造成不孕癥的重要原因之一，發(fā)病原因主要是奶牛產(chǎn)后細菌感染引起。根據(jù)臨床表現(xiàn)不同，可分為急性子宮內膜炎和慢性子宮內膜炎［16］，但無論是急性還是慢性，其臨床表現(xiàn)主要是炎癥反應，因此在研究中藥治療奶牛子宮內膜炎藥理作用時，中藥抗炎作用是一項必不可少的指標。白峰等［15］對大葉桉葉揮發(fā)油的抗炎活性進行研究，表明大葉桉葉油對急慢性炎癥模型表現(xiàn)出較強的抗炎活性;此外，文獻報道藍桉油中主要成分桉油精具有消炎鎮(zhèn)痛作用，可用于治療呼吸道炎癥，如氣管炎、哮喘等［10，17］。本研究設計小鼠耳腫脹和腹腔毛細血管通透性增加兩種炎癥模型以考察桉油精的抗炎活性。結果顯示，桉油精能夠明顯抑制二甲苯所致小鼠耳腫脹，高劑量(400 mg/kg)給藥時對腹腔毛細血管通透性增加亦有顯著的抑制作用，表明桉油精具有抗炎作用，給藥劑量為400 mg/kg時效果最佳，其抗炎實驗結果為進一步研制治療奶牛子宮內膜炎的有效中藥組方提供堅實的理論依據(jù)。

隨著抗生素治療奶牛子宮內膜炎方法的廣泛應用，牛奶中抗生素殘留及細菌耐藥性增加等問題也隨之產(chǎn)生。近年來，中藥因其安全、低毒、低殘留而逐漸成為治療奶牛子宮內膜炎的新趨勢。本實驗結果表明桉油精不僅對奶牛子宮內膜炎主要致病菌有抑制作用，而且能夠促進炎癥的消散，提示桉油精可用于治療奶牛子宮內膜炎，并且有必要進一步研究其對奶牛子宮內膜炎的臨床治療效果。

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