吳 濤，毛婭卿，王 嘉，王 哲，蔣桃珍

(中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081)

高致病性禽流感(Highly Pathogenic Avian Influenza，HPAI)，是由正粘病毒科流感病毒屬A型流感病毒引起的禽類烈性傳染病。自1997年我國香港發(fā)生高致病性禽流感病毒H5N1亞型感染人并致人發(fā)病死亡以來，H5N1禽流感已經(jīng)在全球多個(gè)國家和地區(qū)發(fā)生并致多人發(fā)病，甚至死亡，成為影響人類健康的重要人獸共患?。?］，是世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OlE)規(guī)定的必須報(bào)告的動(dòng)物疫病，我國將其列為一類動(dòng)物疫病。該病的暴發(fā)和流行不僅給養(yǎng)禽業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，而且嚴(yán)重威脅著人類健康和社會(huì)穩(wěn)定。2004年我國及亞洲多個(gè)國家家禽均暴發(fā)了由H5N1亞型病毒導(dǎo)致的高致病性禽流感，給養(yǎng)禽業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。高致病性禽流感在我國暴發(fā)后，農(nóng)業(yè)部采取免疫與撲殺相結(jié)合的防控措施，其中，全面免疫是關(guān)鍵技術(shù)措施和突出特點(diǎn)［2］，因此在較短時(shí)間內(nèi)就控制了禽流感疫情，大大降低了疫病流行帶來的經(jīng)濟(jì)損失。

鴨子是禽流感病毒的貯存庫，因?yàn)樗蠥型流感的HA亞型(H1～H15)和NA亞型(N1～N9)都在鴨體內(nèi)發(fā)現(xiàn)［3］，因此鴨在AIV傳播擴(kuò)散和生物學(xué)進(jìn)化中起了重要作用［4－6］。通常情況下水禽特別是鴨，對(duì)禽流感病毒呈現(xiàn)隱性感染，多數(shù)鴨感染后不發(fā)病但排毒，但近些年來，由于H5N1亞型病毒毒株的不斷變異，許多分離株對(duì)鴨子也具有高致病性，甚至可導(dǎo)致感染鴨100%死亡。雖然現(xiàn)有商品化禽流感疫苗對(duì)家禽具有良好的免疫效果，但對(duì)水禽的免疫效果并不十分理想，臨床上常發(fā)生免疫失?。?］。農(nóng)業(yè)部動(dòng)物疫病防控重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室(設(shè)于華南農(nóng)業(yè)大學(xué))在2007年從野鴨中分離到的H5N2亞型自然弱毒株，命名為A/Duck/D7/2007/(簡稱D7株)，用該毒株研制成功的禽流感滅活疫苗對(duì)水禽有較為理想的免疫保護(hù)效果，同時(shí)其疫苗的抗原譜較廣。本研究通過對(duì)免疫禽流感滅活疫苗(H5N2亞型，D7株)后的鴨用不同高致病性禽流感流行毒株進(jìn)行攻毒，評(píng)估了該滅活疫苗對(duì)鴨的免疫效果。

1 材料和方法

1．1 材料

1．1．1 疫苗 禽流感滅活疫苗(H5N2亞型，D7株)，批號(hào)試005，由廣州市華南農(nóng)大生物藥品有限公司生產(chǎn)提供。

1．1．2 攻毒毒株 6株H5N1亞型高致病性禽流感病毒。其中DK/PY5/2007/(簡稱PY5株)，為疫苗檢驗(yàn)用強(qiáng)毒，由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)提供;DK/S1322/2010/(簡稱 S1322 株)、CK/S1147/2010(簡稱S1147株)、DK/S3224/2010(簡稱 S3224 株)、CK/S1118/2010(簡稱S1118株)和DK/S4102/2010(簡稱S4102株)，均由國家禽流感參考實(shí)驗(yàn)室提供。

1．1．3 抗原及血清 禽流感H5亞型HI試驗(yàn)抗原(D7株)和陽性血清，由廣州市華南農(nóng)大生物藥品有限公司生產(chǎn)提供。

1．1．4 SPF鴨 93只3周齡SPF鴨，由哈爾濱獸醫(yī)研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1．2 方法

1．2．1 免疫與分組 將60只SPF鴨經(jīng)頸部皮下途徑接種禽流感滅活疫苗(H5N2亞型，D7株)，每只接種0．5 mL(1羽份)，其余33只鴨不免疫作為對(duì)照。同條件隔離飼養(yǎng)21 d后，將免疫鴨和對(duì)照鴨隨機(jī)分為6組并逐一編號(hào)，其中免疫鴨每組10只，對(duì)照組5只或6只。

1．2．2 抗體檢測(cè) 免疫后21 d，對(duì)所有免疫及對(duì)照鴨采血，分離血清，用D7株抗原檢測(cè)HI抗體效價(jià);同時(shí)根據(jù)分組，每個(gè)攻毒組分別用相應(yīng)的攻毒毒株抗原檢測(cè)HI抗體效價(jià)。

1．2．3 攻毒及分離病毒 免疫后21 d，每組試驗(yàn)鴨分別通過鼻腔接種1株H5亞型高致病性禽流感病毒毒液0．2mL(含100 LD50)，攻毒后每日觀察鴨的臨床癥狀。攻毒后第5日，采集所有存活鴨喉頭和泄殖腔拭子(病死鴨子的拭子隨時(shí)采集)，進(jìn)行病毒分離，對(duì)病毒分離陰性的樣品則盲傳一代后再進(jìn)行判斷。

2 結(jié)果

2．1 HI抗體效價(jià)檢測(cè) 用D7株抗原檢測(cè)時(shí)，59只免疫鴨的HI抗體效價(jià)幾何平均值(GMT)為7．4 log2，由于為隨機(jī)分組，不同攻毒組免疫鴨的GMT有一定差異，最低為 6．4log2，最高為 8．4log2，對(duì)照鴨抗體均為陰性。用相應(yīng)的攻毒毒株抗原檢測(cè)時(shí)，其HI抗體GMT比用D7株抗原檢測(cè)時(shí)低2．2log2～4．4log2，詳細(xì)結(jié)果見表 1。

表1 HI抗體效價(jià)檢測(cè)結(jié)果

續(xù)表

2．2 病毒分離結(jié)果 在攻毒后5 d采集所有存活鴨喉頭和泄殖腔拭子(病死鴨子的拭子隨時(shí)采集)，進(jìn)行病毒分離，第一次分毒6個(gè)免疫組均為陰性，盲傳時(shí)僅S3224株攻毒組出現(xiàn)2個(gè)陽性樣品，其余各組均為陰性，詳細(xì)結(jié)果見表2。

表2 病毒分離結(jié)果

2．3 攻毒觀察結(jié)果 在攻毒后14 d的觀察期內(nèi)，各免疫組鴨均健活，精神狀況、采食良好，無全身和局部不良反應(yīng)。各攻毒對(duì)照組鴨均出現(xiàn)明顯的禽流感癥狀，除S1147株攻毒組有1只鴨發(fā)病未死亡外，其余均發(fā)病死亡，詳細(xì)結(jié)果見表3。

3 討論

3．1 世界衛(wèi)生組織(WHO)已經(jīng)根據(jù)高致病性流感病毒HA基因特點(diǎn)，將H5N1高致病性禽流感病毒分為不同的進(jìn)化分支(Clade)。到目前為止，H5N1病毒共分為0至9共10個(gè)不同的分支［8］，其中一些分支又進(jìn)化形成了不同的小分支，這些進(jìn)化分支在臨床上的最大意義在于不同分支甚至同一分支內(nèi)部的不同小分支之間的病毒抗原性存在差異，因而對(duì)不同毒株的進(jìn)化分析有利于疫苗株的選用。根據(jù)H5亞型禽流感病毒流行變化情況，我國先后選用了不同的疫苗生產(chǎn)用毒株。例如，Re－1疫苗株屬于0分支，Re－4疫苗株屬于7分支;2．3分支毒株的遺傳特性則較為多樣，其中的2．3．4分支毒株造成了中國、老撾、緬甸和越南等國家的人類感染，Re－5疫苗株就屬于該分支;而2012年為秋季禽流感防控更換的Re－6疫苗株屬于我國近年來主要流行的2．3．2分支，本研究中的D7疫苗株和免疫效果試驗(yàn)選擇的6株H 5N1亞型攻毒毒株也屬于此進(jìn)化分支。雖然HI試驗(yàn)結(jié)果表明疫苗株與攻毒株在抗原性上存在較大差異，但攻毒后對(duì)鴨仍然能產(chǎn)生良好的免疫保護(hù)作用，并有效阻止排毒。

表3 免疫組和對(duì)照組攻毒觀察結(jié)果

3．2 水禽感染禽流感病毒，過去通常認(rèn)為隱性帶毒感染，目前水禽禽流感發(fā)生與流行出現(xiàn)了新變化，如番鴨、鵝和北京鴨等水禽出現(xiàn)發(fā)病并死亡［9］。由于D7疫苗株和目前國內(nèi)H5N1流行株病毒屬于同一進(jìn)化分支，且具有雞胚生長的高度適應(yīng)性和自然低致病性的特點(diǎn)和優(yōu)點(diǎn)，因而是理想的疫苗種毒株。本研究通過用疫苗檢驗(yàn)用毒株和5個(gè)禽流感流行毒株進(jìn)行攻毒保護(hù)試驗(yàn)，表明用該毒株制備的疫苗具有良好的免疫保護(hù)效果，該疫苗的推廣使用將對(duì)水禽禽流感的防控發(fā)揮重要作用。

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