張 璐，樂愛山，鄭 玲，孔祥虹

(1．陜西出入境檢驗(yàn)檢疫局，陜西 西安 710068;2．廣西出入境檢驗(yàn)檢疫局，廣西 南寧 530022)

酶制劑是果汁加工過程中廣泛使用的加工助劑［1－3］，常用的有淀粉酶、果膠酶、蛋白酶、糖化酶、脂肪酶、超濾酶等。果汁生產(chǎn)中使用多種酶制劑以提高加工效率，增加產(chǎn)品穩(wěn)定性，如使用淀粉酶來轉(zhuǎn)化未成熟果實(shí)中的淀粉，使用果膠酶以除去榨汁中的果膠，使用超濾酶增加果汁超濾時的通過率。但用米曲霉發(fā)酵產(chǎn)生的酶制劑可能含有強(qiáng)毒物質(zhì)3-硝基丙酸(3-Nitropropionic acid，3-NPA)。3-硝基丙酸是一種無色針狀晶體，為高等植物受霉菌污染產(chǎn)生的有毒物質(zhì)，可引起牲畜中毒，其中毒癥狀主要表現(xiàn)為中樞神經(jīng)系統(tǒng)的損害［4－7］，急性期表現(xiàn)有嘔吐、眩暈、陣發(fā)性抽搐、昏迷等，嚴(yán)重可導(dǎo)致死亡。聯(lián)合圍糧農(nóng)組織和世界衛(wèi)生組織關(guān)于食品添加劑的聯(lián)合專家委員會(Joint FAO/WHO Expert Committee on Food Additives)在1987即明確規(guī)定用米曲霉發(fā)酵生產(chǎn)的淀粉酶、蛋白酶、葡萄糖化酶、脂肪酶等時均要檢測3-NPA。

目前對于3-NPA的檢測主要集中在甘蔗及甘蔗制品［8－9］，且檢測方法多為高效液相色譜法［10］、氣相色譜法［11］、薄層色譜法［8］等。但這些方法均存在樣品前處理繁瑣、需使用大量毒性大的有機(jī)試劑、干擾較大或需要進(jìn)行衍生等問題。本文通過對提取、凈化、測定及確證等條件的研究及優(yōu)化，建立了檢測酶制劑中3-NPA的固相萃取/超高效液相色譜電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜方法，可實(shí)現(xiàn)對3-NPA的定性及定量分析。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與材料

Waters ACQULTY UPLC－Quattro Premier XE液相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國Waters公司);冷凍離心機(jī)(美國Beckman公司);漩渦混合儀(德國IKA公司);LABOROTA4001旋轉(zhuǎn)濃縮儀(德國Heidolph公司);Milli-Q超純水儀(美國Millipore公司)。

3-NPA(97.5%，Dr.Ehrenstorfer公司);乙腈(色譜純，F(xiàn)isher公司);氯化鈉、無水硫酸鈉均為分析純，無水硫酸鈉使用前于600℃馬弗爐中烘烤5 h后密封保存。PSA固相萃取柱(3 mL，500 mg，Supelco公司)。

3-NPA標(biāo)準(zhǔn)儲備液的配制:稱取標(biāo)準(zhǔn)品10.0 mg于10 mL棕色容量瓶，用甲醇溶解并定容至10 mL，配成1.0 g/L的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，于－20℃下保存。3-NPA標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的配制:取上述儲備液0.025 mL于棕色容量瓶中，用甲醇定容至25 mL，配制成1.0 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.2 樣品前處理

1.2.1 液體酶制劑中3-NPA的提取 稱取5.00 g酶制劑樣品于50 mL離心管中，加入20 mL乙腈振蕩20 min后，再加入5 g氯化鈉混合均勻后振蕩10 min，以4 500 r/min離心5 min。取上清液10 mL，待凈化。

1.2.2 固體酶制劑中3-NPA的提取 稱取5.00 g酶制劑樣品于50 mL離心管中，加入20 mL乙腈振蕩20 min后，以4 500 r/min離心5 min。取上清液10 mL，待凈化。

1.2.3 凈 化 PSA固相萃取柱上加1.0 g無水硫酸鈉后用6 mL乙腈活化，將試樣溶液過柱，用10 mL甲醇洗脫，收集洗脫液。經(jīng)氮?dú)獯抵两珊?，?.5% 甲酸水溶液定容至1.0 mL，過0.22 μm濾膜后，待測。

1.3 儀器條件

色譜條件:色譜柱Waters HSS T3柱(1.8 μm，2.1 mm×100 mm)。流動相為乙腈(A)和水(B)，梯度洗脫程序:0～0.5 min，3% ～10%A;0.5～2.0 min，10% ～80%A;2.0～2.8 min，80%A;2.8～3.5 min，80% ～3%A;3.5～4.5 min，3%A。流速0.3 mL/min，進(jìn)樣體積5.0 μL，柱溫40℃。

MS/MS條件:離子源為電噴霧電離源，負(fù)離子模式(ESI－)，毛細(xì)管電壓為2.91 kV;離子源溫度115℃;脫溶劑氣溫度:450℃;脫溶劑氣流量500 L/h;碰撞氣為氬氣，流量為0.2 mL/min;錐孔電壓13 V;碰撞能量10 eV;檢測模式為多反應(yīng)監(jiān)測(MRM);母離子為m/z117.9;特征離子為m/z46.3。

2 結(jié)果與討論

2.1 前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

考察了甲醇、乙腈、乙酸乙酯等不同有機(jī)溶劑的提取效果。結(jié)果表明，甲醇的提取率為90%但干擾較大，乙酸乙酯的提取率僅為70%，而乙腈的提取率達(dá)到95%且干擾較少。同時在提取過程中加入氯化鈉將水相和有機(jī)相分離。適量的氯化鈉在離心后加入有助于減少有機(jī)溶劑中的漂浮物，使樣品更清澈，有利于固相萃取的進(jìn)行。

2.2 固相萃取柱的選擇

據(jù)文獻(xiàn)報道［12］，可采用乙酸乙酯和三氯甲烷液液萃取的方式提取凈化甘蔗中的3-NPA。但該方法的溶劑使用量大，且多次萃取容易造成待測物損失。本研究中采用固相萃取技術(shù)完成目標(biāo)化合物的富集及凈化。實(shí)驗(yàn)考察了不同萃取柱(Oasis WAX、PSA及氨基柱)的凈化效果，結(jié)果顯示，對酸性物質(zhì)有較好選擇性的Oasis MAX柱［13］雖能將目標(biāo)物完全保留在小柱上，但無合適的洗脫液將目標(biāo)物洗脫下來。

實(shí)驗(yàn)中比較了特征相似的氨基柱和PSA柱的凈化效果。使用加標(biāo)的乙腈溶液上固相萃取柱后，收集上柱溶液進(jìn)行分析，3-NPA完全保留在氨基柱和PSA柱上。研究表明當(dāng)強(qiáng)極性化合物在氨基柱上吸附力太強(qiáng)時可考慮用PSA柱代替［14］。比較了3-NPA的乙腈溶液在氨基柱和PSA柱上的解吸能力，在實(shí)驗(yàn)中用不同的洗脫液分別洗脫吸附在兩種固相萃取柱上的3-NPA(見圖1)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，過PSA固相萃取柱的回收率高于氨基柱，可能是由于目標(biāo)化合物3-NPA在氨基柱上吸附過強(qiáng)。因此實(shí)驗(yàn)選擇PSA柱為固相萃取柱進(jìn)行進(jìn)化。

圖1 3-NPA在不同固相萃取柱上的解離圖Fig.1 Figure of dissociation of 3-NPA in different solid phase extraction columns

2.3 PSA固相萃取條件的優(yōu)化

為了提高凈化效果和降低基質(zhì)效應(yīng)，一般會對固相萃取柱進(jìn)行淋洗。實(shí)驗(yàn)考察了不同體積比(10∶90、12∶88、20∶80)的異丙醇－乙腈作為淋洗液時3-NPA的損失情況。結(jié)果表明，用上述淋洗液后3-NPA均有損失。因此實(shí)驗(yàn)不采用淋洗步驟，而通過基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線降低基質(zhì)效應(yīng)的影響。

吸附于PSA固相萃取柱上的目標(biāo)化合物，需要強(qiáng)極性溶劑進(jìn)行洗脫。實(shí)驗(yàn)考察了乙腈、甲醇以及不同體積比的乙腈－甲醇(50∶50、30∶70、10∶90)溶液的洗脫能力，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，甲醇比例越高，吸附在PSA柱上的3-NPA越容易洗脫下來。最終選擇100%甲醇作為洗脫溶液。進(jìn)一步考察了甲醇用量(3、5、8、10、15、20 mL)的影響，結(jié)果顯示當(dāng)洗脫溶液體積達(dá)到10 mL時，3-NPA已被全部洗脫下來，最終確定10 mL甲醇為洗脫溶液。

2.4 色譜柱的選擇

文獻(xiàn)報道使用反相色譜柱分離3-NPA時，由于3-NPA具有很強(qiáng)的酸性和親水性，在反相柱上保留較弱，因此需要使用磷酸二氫鉀溶液作為流動相［15］。由于液質(zhì)聯(lián)用不建議用磷酸鹽等不揮發(fā)性物質(zhì)為流動相，因此實(shí)驗(yàn)重點(diǎn)考察了有利于極性物質(zhì)保留的反相色譜柱Waters ACQUITY HSS T3、Waters ACQUITY C18、Aglient Eclipse Plus C18、Waters UPLC BEH Amide及親水性色譜柱Waters ACQUITY BEH HILIC對3-NPA的分離效果(見圖2)。結(jié)果表明，3-NPA在Waters ACQUITY C18及Aglient Eclipse Plus C18的保留時間均在0.7 min，且峰形拖尾，在Waters ACQUITY BEH HILIC及Waters UPLC BEH Amide上的峰形盡管有所改善但仍有拖尾。而3-NPA在Waters ACQUITY HSS T3上的保留時間在1.5 min，且峰形良好。因此選擇Waters ACQUITY HSS T3作為3-NPA的分析柱。

圖2 3-NPA在不同色譜柱上的保留色譜圖Fig.2 Chromatograms of retention of 3-NPA on different columns A．Waters ACQUITY C18(1.8 μm，2.1 mm ×100 mm);B．Aglient Eclipse Plus C18(1.8 μm，2.1 mm ×100 mm);C．ACQUITY BEH HILIC(1.8 μm，2.1 mm ×100 mm);D．Waters UPLC BEH Amide(1.7 μm，2.1 mm ×100 mm);E．Waters ACQUITY HSS T3(1.8 μm，2.1 mm ×100 mm)

2.5 流動相條件的優(yōu)化

由于3-NPA是一種小分子有機(jī)酸，具有較強(qiáng)的酸性和親水性。因此主要考察了甲醇－水、乙腈－水、乙腈－5 mmol/L乙酸銨溶液體系的分離效果。結(jié)果表明，乙腈－水為流動相時的響應(yīng)最高，且保留時間在1.5 min以后。流動相中加鹽后靈敏度降低，可能是鹽的存在抑制了目標(biāo)化合物的電離。因此確定乙腈－水為最佳流動相。

為了增強(qiáng)目標(biāo)化合物在色譜柱上的保留。實(shí)驗(yàn)比較了純水、0.1%氨水溶液、0.05%甲酸水溶液、0.5%甲酸水溶液、5 mmol/L甲酸銨溶液作為定容液時對目標(biāo)化合物響應(yīng)的影響。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，用0.5%甲酸水溶液作為定容溶液時不僅保留時間明顯增強(qiáng)，且響應(yīng)也明顯增強(qiáng)。最終確定0.5%甲酸水溶液作為定容溶液。

2.6 基質(zhì)干擾的影響

由于酶制劑大多由真菌菌種發(fā)酵而成，含有大量蛋白，因此對3-NPA的提取及測定有干擾，且無法得到3-NPA的同位素內(nèi)標(biāo)。因此選擇基質(zhì)加標(biāo)工作曲線進(jìn)行外標(biāo)法定量，對基質(zhì)效應(yīng)及凈化過程中的損失進(jìn)行校正。以果膠酶為例，不采用果膠酶基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)時，加標(biāo)5.0 μg/kg的回收率為32.1%～42.1%，而采用基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)后，回收率為63.2%～79.6%?；厥章侍岣吡?倍。實(shí)驗(yàn)還比較了不同酶制劑為基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)對3-NPA檢測的干擾校正情況(見圖3)，不同酶制劑對3-NPA的干擾影響不同，果膠酶對3-NPA的抑制干擾最大，果膠超濾酶的干擾較小，因此實(shí)驗(yàn)需要對不同品種的酶制劑進(jìn)行基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)校正，進(jìn)而進(jìn)行定量分析。

圖3 不同酶制劑的基質(zhì)影響效應(yīng)Fig.3 The matrix effects of different zymins

2.7 方法驗(yàn)證參數(shù)

對不同種類的酶制劑繪制基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線。分別稱取6份5.0 g空白酶制劑基質(zhì)于50 mL離心管中，分別加入1.0 μg/L標(biāo)準(zhǔn)工作溶液25、50、100、150、250 μL，進(jìn)行前處理后在優(yōu)化條件下測定。以3-NPA的峰面積(Y)對相應(yīng)的質(zhì)量濃度(X，μg/L)繪制基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。得出回歸方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍及定量下限(S/N≥10)(見表1)。結(jié)果顯示，3-硝基丙酸在6種酶制劑基質(zhì)中的線性范圍均為12.5 ～125 μg·L－1，相關(guān)系數(shù)大于 0.993，定量下限為 5.0 μg/kg。

表1 不同酶制劑的回歸方程、相關(guān)系數(shù)(r)、線性范圍及定量下限Table 1 Regression equation，correlation coefficient(r)，linearity range and detection limit in different zymin

分別稱取不含3-NPA的空白果膠酶、果膠超濾酶、諾維信復(fù)合果膠酶、蛋白酶、蔗糖酶樣品進(jìn)行方法回收率和精密度試驗(yàn)。加入的3-NPA標(biāo)準(zhǔn)品濃度分別為5.0、10.0、20.0 μg/kg，每種濃度做5次平行，按優(yōu)化方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。每種樣品的平均回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)見表2。在3個加標(biāo)水平下，3-硝基丙酸的回收率為69.1%～114.4%，RSD為6.9%～8.9%。

表2 3-NPA在不同種類酶制劑的加標(biāo)回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差Table 2 Recovery and precision of 3-NPA in different enzymic preparations

2.8 方法應(yīng)用

為了考察本方法的有效性與實(shí)用性，采購7種常用的酶制劑樣品進(jìn)行3-NPA的檢測。結(jié)果表明，所有樣品中均未檢出3-NPA殘留。圖4為酶制劑實(shí)際樣品的色譜圖。

圖4 果膠酶樣品(A)及樣品加標(biāo)(B)的色譜圖Fig.4 Chromatograms of pectinase sample(A)and sample spiked with 3-NPA(B)

3 結(jié)論

本文建立了酶制劑中3-NPA的超高效液相色譜－電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜檢測方法。樣品經(jīng)乙腈提取，固相萃取柱凈化，質(zhì)譜確認(rèn)后，可實(shí)現(xiàn)對3-NPA的定性及定量分析。該方法前處理過程簡便、靈敏度高、選擇性好，可滿足日常檢測的需要，為酶制劑的質(zhì)量安全提供了技術(shù)保障。

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