李 宏，吳海武，孟凡同，孫樂(lè)弟，謝珍玉，李立英

(1.海南大學(xué)熱帶生物資源可持續(xù)利用省部共建國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，海南?？?70228;2.海南大學(xué)海南省水生生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南大學(xué)海洋學(xué)院，海南海口570228;3.廣東輕工職業(yè)技術(shù)學(xué)院食品與生物工程系，廣東廣州510300)

高密度、集約化的水產(chǎn)養(yǎng)殖中產(chǎn)生的大量殘餌、動(dòng)物殘?bào)w和排泄物等，導(dǎo)致了養(yǎng)殖水體理化環(huán)境的惡化，從而致使水產(chǎn)動(dòng)物病害的種類(lèi)、數(shù)量、范圍以及危害程度日益增加［1］.因地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)能分泌多種高活性的胞外酶，主要有蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶等水解酶，可有效地將水體中的有機(jī)物降解為小分子物質(zhì)，又能有效地去除水體中的氨氮、亞硝酸態(tài)氮、硝態(tài)氮和COD，還能通過(guò)拮抗作用抑制致病菌的生長(zhǎng)，因此，該菌已廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)［2－5］.該細(xì)菌常與多種其他芽孢桿菌形成復(fù)雜的微生物群落，且菌落形態(tài)與其他芽孢桿菌極為相似，因而難以直接從傳統(tǒng)培養(yǎng)基中分離而獲得地衣芽孢桿菌菌株.自PCR檢測(cè)方法建立以來(lái)，基于保守基因設(shè)計(jì)引物的PCR檢測(cè)技術(shù)具有快速、特異性強(qiáng)、靈敏度高等特點(diǎn)，故其一直是微生物快速檢測(cè)的有效手段.為了克服傳統(tǒng)的芽孢桿菌檢測(cè)方法費(fèi)時(shí)費(fèi)力的缺陷和滿(mǎn)足規(guī)模化、工廠化生產(chǎn)對(duì)地衣芽胞桿菌菌株的需求，建立地衣芽孢桿菌的PCR快速檢測(cè)方法，是今后從海洋環(huán)境中分離目的芽孢桿菌并發(fā)展與該環(huán)境相適應(yīng)的地衣芽孢桿菌制劑所亟待解決的重要問(wèn)題.普遍存在于細(xì)菌中的單拷貝gyrB基因，是編碼促旋酶B亞單位的基因，該基因進(jìn)化速度快，每100萬(wàn)年的平均堿基替換率為0.7% ～0.8%，是國(guó)內(nèi)外公認(rèn)的細(xì)菌鑒定的主要靶基因之一［6－7］，已成功應(yīng)用于蛭弧菌屬(Bdellovibrio)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、巴氏肺炎球菌(Pasteurella pneumotropica)和苯酚分解菌等菌種的快速鑒定［8］.筆者以PCR技術(shù)為基礎(chǔ)，參考GenBank中6株地衣芽孢桿菌和其他2株芽孢桿菌的gyrB序列，設(shè)計(jì)了一對(duì)特異性引物，通過(guò)PCR反應(yīng)體系與條件優(yōu)化、特異性和靈敏度檢測(cè)等，成功建立了基于gyrB基因的地衣芽孢桿菌PCR快速檢測(cè)方法，為今后從復(fù)雜的海洋環(huán)境中快速分離地衣芽孢桿菌奠定了良好的基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種 芽孢桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株為:1株地衣芽孢桿菌Bacillus licheniformis(ATCC6633)，2株枯草芽孢桿菌B.subtilis(ATCC11091、ATCC14591)，1株巨大芽孢桿菌B.megaterium(ATCC9732)，均購(gòu)自中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心;用于特異性檢測(cè)的其他菌株為弗氏弧菌Vibrio furnissii(ATCC33813)，需納弧菌V.natr-iegens(ATCC33788)，擬態(tài)弧菌V.mimicus(ATCC33653)，河流弧菌V.fluvialis(ATCC33830)，副溶血弧菌V.parahaemolyticus(ATCC17802)，亦購(gòu)自中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心;創(chuàng)傷弧菌V.vulnificus(CCRC12905)購(gòu)自廣東省微生物菌種保藏中心;藤黃微球菌Micrococcus luteus(12－001)，金黃色葡萄球菌Staphyloccocus aureus(12－002)，由廈門(mén)大學(xué)饋贈(zèng)并保存于海南大學(xué)海洋學(xué)院健康養(yǎng)殖與病害控制實(shí)驗(yàn)室;大腸桿菌Escherichia coli(D31170D18)由美國(guó)北卡州立大學(xué)饋贈(zèng);鰻弧菌V.anguillarum(12－026)為海南大學(xué)海洋學(xué)院健康養(yǎng)殖與病害控制實(shí)驗(yàn)室保存.

1.1.2 培養(yǎng)基 普通海水固體培養(yǎng)基:牛肉膏3 g，酵母粉1 g，胰蛋白酶5 g，NaCl 30 g，瓊脂15 g，ddH2O 1 L，pH7.2，121 ℃滅菌 20 min. 營(yíng)養(yǎng)肉湯液體培養(yǎng)基:牛肉膏 3 g，胰蛋白胨 10 g，NaCl 5 g，ddH2O 1 L，pH7.2，121 ℃滅菌20 min.營(yíng)養(yǎng)肉湯固體培養(yǎng)基:牛肉膏3 g，胰蛋白胨10 g，NaCl 5 g，瓊脂15 g，ddH2O 1 L，pH7.2，121 ℃滅菌20 min.LB 固體培養(yǎng)基:蛋白胨 10 g·L－1，酵母粉 5 g·L－1，NaCl 10 g·L－1，瓊脂15 g·L－1.TCBS瓊脂培養(yǎng)基購(gòu)自北京路橋技術(shù)有限公司，牛肉膏購(gòu)自北京奧博星生物技術(shù)有限公司，胰蛋白胨、酵母粉購(gòu)自北京拜爾迪生物技術(shù)有限公司，NaCl購(gòu)自廣州化學(xué)試劑廠，瓊脂購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司.

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌培養(yǎng) 試驗(yàn)所用的弧菌菌株均在TCBS瓊脂培養(yǎng)基上劃線(xiàn)培養(yǎng);所有的芽孢桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株均在營(yíng)養(yǎng)肉湯固體培養(yǎng)基上劃線(xiàn)培養(yǎng);大腸桿菌、藤黃微球菌、金黃色葡萄球菌在LB固體培養(yǎng)基上劃線(xiàn)培養(yǎng);其他細(xì)菌在普通海水固體培養(yǎng)基上劃線(xiàn)培養(yǎng).挑取每種細(xì)菌的單菌落，接種至營(yíng)養(yǎng)肉湯液體培養(yǎng)基中，所有的弧菌于180 r·min－1、30℃條件下振蕩培養(yǎng)14 h，其他細(xì)菌于180 r·min－1、37℃條件下振蕩培養(yǎng)14 h，所得的菌液用于DNA提取試驗(yàn).

1.2.2 DNA提取 按照北京艾德萊生物科技有限公司的細(xì)菌基因組DNA快速提取試劑盒的說(shuō)明要求提取，DNA樣品保存于－20℃?zhèn)溆?

1.2.3 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)GeneBank中的6株地衣芽孢桿菌的gyrB基因序列(AB307803.1，AB307802.1，CP000002.3，DQ309324.1，DQ309295.1，AE017333.1)和 2 株其他芽孢桿菌的 gyrB 基因序列(JQ963604.1，JQ963602.1)，利用 OLIGO 6.0軟件設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物 F1(5'－TGGAGATACGGAAGTGACGGGA －3')和R1(5'－AGAGCCACCTCGACTGTAATGC－3')，并在GenBank中做引物特異性分析，預(yù)期擴(kuò)增長(zhǎng)度為303 bp.引物由北京六合華大基因科技股份有限公司合成.

1.2.4 PCR反應(yīng)體系和條件的優(yōu)化 根據(jù)上面設(shè)計(jì)的特異性引物，對(duì)Taq酶(中科瑞泰(北京)生物科技有限公司)、dNTPs(中科瑞泰(北京)生物科技有限公司)、Mg2+和退火溫度(Tm)等影響PCR反應(yīng)的主要因子進(jìn)行優(yōu)化(見(jiàn)表1)，其中，Taq 酶設(shè)0.5，0.75，1，1.25，1.5 U 5 個(gè)水平;dNTPs設(shè) 0.1，0.15，0.2，0.25，0.3，0.4 mmol·L－16 個(gè)水平;Mg2+設(shè) 1.25，1.875，2.50，3.175，3.75 mmol·L－15 個(gè)水平;Tm設(shè) 52，54，56，58，60，62 ℃ 6 個(gè)水平. 反應(yīng)體系為50 μL，含 DNA 模板1 μL，引物對(duì)各1 μL，其他用無(wú)菌 ddH2O 補(bǔ)足.反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性4 min，94℃變性1 min，60℃退火1 min，72℃延伸2 min，完成30個(gè)循環(huán)后，72℃延伸10 min.

1.2.5 特異性檢測(cè) 依次吸取芽孢桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株和特異性檢測(cè)菌株的DNA模板提取液1 μL，按照優(yōu)化后的PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件進(jìn)行擴(kuò)增.

1.2.6 靈敏度檢測(cè) 通過(guò)紫外分光光度計(jì)(U-3900UV-VIS購(gòu)自Hitachi High-Technologies Corporation Tokyo Japan)檢測(cè)，得到地衣芽孢桿菌DNA提取液濃度，用無(wú)菌ddH2O將DNA提取液依次進(jìn)行10倍梯度稀釋?zhuān)沧?8 個(gè)稀釋度，分別為 10－2，10－3，10－4，10－5，10－6，10－7，10－8，10－9mg·L－1. 然后依次取 1 μL不同稀釋度的DNA溶液進(jìn)行PCR擴(kuò)增(50 μL體系)檢測(cè).

2 結(jié)果

2.1 PCR反應(yīng)體系和條件的建立 應(yīng)用引物F1和R1，通過(guò)對(duì)PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件的優(yōu)化，建立了地衣芽孢桿菌特異性檢測(cè)的PCR反應(yīng)體系，從地衣芽孢桿菌基因組中擴(kuò)增并獲得了長(zhǎng)度為303 bp的DNA 片段 (見(jiàn)圖1). 其中，PCR 擴(kuò)增反應(yīng)體系為:Taq酶 1U，dNTPs 0.2 mmol·L－1，Mg2+2.50 mmol·L－1，10 × Taq buffer(Mg2+plus)5 μL，F(xiàn)1(10 μmol·L－1)1 μL，R1(10 μmol·L－1)1 μL，DNA 模板 1 μL，無(wú)菌ddH2O補(bǔ)足至50 μL.反應(yīng)條件為:94℃預(yù)變性4 min，94℃變性1 min，62℃退火1 min，72℃延伸2 min，完成30個(gè)循環(huán)后，72℃延伸10 min.

圖1 地衣芽孢桿菌產(chǎn)生明顯的DNA片段

圖2 特異性檢驗(yàn)結(jié)果

2.2 特異性檢測(cè) 引物F1和R1的PCR特異性擴(kuò)增中只有地衣芽孢桿菌產(chǎn)生更利于觀察的明顯的大小為303 bp的目標(biāo)片段，符合預(yù)期擴(kuò)增產(chǎn)物DNA片段的大小;另外3株芽孢桿菌(高濃度模板)只產(chǎn)生非常微弱的DNA片段;而其他非芽孢桿菌菌株的PCR擴(kuò)增均無(wú)DNA片段(見(jiàn)圖2).因此引物F1和R1對(duì)地衣芽孢桿菌有較強(qiáng)的特異性，可用于地衣芽孢桿菌PCR快速檢測(cè).

圖3 引物F1靈敏性檢測(cè)結(jié)果

2.3 靈敏性檢測(cè) DNA提取液稀釋100倍后，OD260值為 0.020，OD280值為 0.012，OD230值為0.092，DNA提取液純度較高，DNA提取液質(zhì)量濃度為100 mg·L－1.從靈敏性檢測(cè)結(jié)果可知，引物F1和R1對(duì)地衣芽孢桿菌的靈敏度為1×10－3mg·L－1(見(jiàn)圖3).由于地衣芽孢桿菌基因組約為4.2×106bp，因此可知，該方法的檢測(cè)靈敏度約為200個(gè)細(xì)菌/反應(yīng)，遠(yuǎn)低于每克海洋環(huán)境樣品中的芽孢桿菌數(shù)量.因此，該方法可用于海洋環(huán)境樣品中地衣芽孢桿菌的檢測(cè).

3 討論

由于地衣芽孢桿菌可有效地促進(jìn)養(yǎng)殖水體的生態(tài)良性循環(huán)，且無(wú)毒副作用，因此，它一直是芽孢桿菌水體改良菌劑的重要菌種之一.不過(guò)，與其他細(xì)菌一樣，雖然地衣芽孢桿菌廣泛存在于多種環(huán)境中，但亦存在多種不同的地理種群，不同地理種群的菌株對(duì)環(huán)境的適應(yīng)性存在較大的差異(Dhakal et al，2013)，因此，從環(huán)境中快速篩選地衣芽孢桿菌是發(fā)展基于土著地理種群的地衣芽孢桿菌制劑的重要基礎(chǔ).地衣芽孢桿菌的傳統(tǒng)鑒定方法，主要是根據(jù)細(xì)菌的形態(tài)學(xué)特性和理化性質(zhì)，這不僅繁瑣耗時(shí)，而且往往會(huì)得到假陽(yáng)性的結(jié)果.16S rDNA技術(shù)已廣泛應(yīng)用于細(xì)菌鑒定，而且取得了較明顯的效果，但是應(yīng)用于鑒定枯草群芽孢桿菌時(shí)，如枯草芽孢桿菌(B.subtilis)、解淀粉芽孢桿菌(B.amyloliquefaciens)、地衣芽孢桿菌(B.licheniformis)、短小芽孢桿菌(B.pumilus)、萎縮芽孢桿菌(B.atrophaeus)，其檢測(cè)效果有時(shí)并不穩(wěn)定［9－11］.鑒于多種功能基因在系統(tǒng)進(jìn)化的過(guò)程中具有非常保守的特點(diǎn)，因此，其能夠代表種及種以下水平的進(jìn)化方向，如 gyrA，gyrB，rpoA，rpoB，cheA，spoOA等［8，12－15］.雖然本文建立的地衣芽孢桿菌快速檢測(cè)的方法對(duì)高質(zhì)量濃度(＞100 mg·L－1)的枯草芽孢桿菌和巨大芽孢桿菌的DNA模版僅可產(chǎn)生極其微弱的擴(kuò)增，但對(duì)地衣芽孢桿菌的檢測(cè)靈敏度(0.001 mg·L－1)卻明顯高于其他芽孢桿菌，因此，本文建立的基于gyrB基因的地衣芽孢桿菌的PCR快速檢測(cè)方法的可靠性、區(qū)分度和靈敏度都較高.

在地衣芽孢桿菌的快速檢測(cè)方面，早已開(kāi)展了諸多有益的探索，如應(yīng)用多重PCR檢測(cè)方法［16］、多位點(diǎn)可變分析法［17］、real-time PCR［18］等.雖然這些方法也滿(mǎn)足對(duì)地衣芽孢桿菌的快速檢測(cè)要求，然而，上述方法在實(shí)際操作過(guò)程中相對(duì)于傳統(tǒng)PCR操作的要求更高，對(duì)儀器設(shè)備的要求也較高，這不利于在一般實(shí)驗(yàn)室或者工廠化條件下開(kāi)展地衣芽孢桿菌的快速檢測(cè).本研究基于gyrB基因，通過(guò)設(shè)計(jì)特異性引物對(duì)成功建立了地衣芽孢桿菌的PCR快速檢測(cè)方法，相對(duì)于上述檢測(cè)方法，該方法操作簡(jiǎn)單、檢測(cè)靈敏度高，在種的水平上具有高度特異性，可以快速?gòu)奈⑸锝Y(jié)構(gòu)復(fù)雜的海洋環(huán)境中篩選和鑒定地衣芽孢桿菌，具有較強(qiáng)的實(shí)用性.

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