王 珺，王愛雯，陳國華，吳小易，符麗梅

(1.海南大學 海洋學院，海南 ?？?70228;2.海南大學 熱帶生物資源教育部重點實驗室，海南 海口570228;3.海洋生物實驗教學中心，海南 ?？?70228)

在硅藻的培養(yǎng)中，除了生態(tài)因子(溫度、鹽度、光照和pH)外，4種營養(yǎng)元素(氮、磷、鐵、硅)被認為是影響硅藻生長的重要營養(yǎng)因子.

直鏈藻(Melosira sp.)是一種褐色的微小海洋浮游硅藻，屬硅藻門、中心硅藻綱、圓篩藻目、圓篩藻科、直鏈藻屬.該硅藻分離自海南省文昌市翁田鎮(zhèn)海區(qū)，藻體為單細胞或鏈狀藻體，是水產養(yǎng)殖中的一種重要的餌料生物.水溫超過18℃時，直鏈藻藻體以單細胞形式生存［1］.目前，直鏈藻在水產動物人工育苗上已經得到很好的應用，路建明等［2］的研究結果表明:以直鏈藻強化的輪蟲所投喂的蚤狀幼體成活率最高(15.2%)，海水小球藻(Chlorella)次之(11.5%).王慶等［3］的研究表明，經直鏈藻強化的輪蟲(Rotifer)所培養(yǎng)的中華絨螯蟹蚤狀幼體(Eriocheir sinensis Zoea)的DHA和EPA含量分別為7.24%和15.09%，顯著高于未經直鏈藻強化的酵母輪蟲(Yeast Rotifer)所培養(yǎng)的蚤狀幼體(P＜0.05);吳學軍等［4］的研究結果表明，經過直鏈藻強化的輪蟲所投喂的蚤狀幼體的成活率及變態(tài)時間均優(yōu)于其他海洋微藻強化的褶皺臂尾輪蟲(Brachionus plicatilis)所投喂的蚤狀幼體的成活率及變態(tài)時間.劉德經等［5］進行了西施舌(Coelomactra antiquata)的食譜分析，發(fā)現直鏈藻對西施舌的生長有重要的影響作用.吳學軍等［6］的研究表明，直鏈藻是中華絨螯蟹蚤狀幼體的適宜開口餌料.在水產動物人工育苗的餌料生產上，人工培養(yǎng)直鏈藻的技術已受到了廣泛的重視，如Nobutada等［7］研究了自然環(huán)境下意大利直鏈藻(Melosira italica)的同步生長;Toledo等［8］研究了腐殖酸對意大利直鏈藻的生長和忍受力的影響;筆者先前也曾研究過溫度、光照、鹽度和pH值對直鏈藻生長速率的影響［9］.然而至今為止，氮、磷、鐵、硅4因子組合對直鏈藻生長速率的影響未見報道.為此，筆者通過單因子和正交實驗，研究了氮、磷、鐵、硅4種營養(yǎng)鹽對直鏈藻生長的影響，旨在確定培養(yǎng)直鏈藻的最佳培養(yǎng)基，以便為直鏈藻的大規(guī)模培養(yǎng)提供參考.

圖1 直鏈藻顯微攝像圖

1 材料與方法

1.1 材料 實驗用的直鏈藻(見圖1)來自海南大學海洋學院微藻保種室.實驗前在1 000 mL的三角燒瓶中活化純培養(yǎng)，不充氣，每天搖動4次，實驗藻種為指數生長期的藻液，營養(yǎng)鹽試劑為AR級.

1.2 方法

1.2.1 藻體培養(yǎng)條件 實驗海水取自?？谑忻捞m區(qū)白沙門海區(qū)，經水泥池沉淀、脫脂棉過濾、煮沸、冷卻后使用.藻種的培養(yǎng)基采用寧波大學3號配方［10］，考慮到硅藻對硅元素的需求，所以培養(yǎng)液(硅實驗例外)均再加入10 mg·L－1的硅酸鈉.實驗用培養(yǎng)瓶均為250 mL的齒輪牌三角瓶，經洗液洗滌和晾干后，在電熱鼓風干燥箱中于130℃恒溫消毒2 h.培養(yǎng)溫度控制在(25±1)℃(除溫度實驗外)，光照強度為(3 000±100)lx(除光照實驗外)，鹽度31，pH值8.01，光周期為全日照，培養(yǎng)時間為4 d，每天搖動3次，并隨機交換位置，以減少誤差.

1.2.2 實驗設計

1.2.2.1 單因子實驗 分別配制缺氮、缺磷、缺鐵的3號培養(yǎng)液，氮單因子實驗分別添加不同氮質量濃度的硫酸銨、硝酸鈉和尿素3種營養(yǎng)鹽.氮鹽實驗設置的質量濃度梯度為0，10，20，30，40，50，60 mg·L－1;磷鹽單因子實驗分別添加不同磷質量濃度的磷酸二氫鉀和磷酸二氫鈉2種營養(yǎng)鹽，磷鹽實驗設置的質量濃度梯度為 0，0.5，1，2，3，4，5 mg·L－1;鐵鹽單因子實驗分別添加不同鐵質量濃度的硫酸亞鐵和檸檬酸鐵 2 種營養(yǎng)鹽，實驗設置的質量濃度梯度為 0，0.02，0.05，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5 mg·L－1;硅鹽單因子實驗添加不同硅質量濃度的 Na2SiO3，實驗設置的硅質量濃度梯度為 0，5，10，15，20，25，30，35，40 mg·L－1.各實驗均設置2個平行組.

1.2.2.2 正交實驗 從4種營養(yǎng)鹽的單因子實驗結果中分別選出最佳的營養(yǎng)鹽種類及其3個水平，選用L12(34)［11］設計進行4因子3水平的正交實驗(見表1).

表1 L12(34)正交實驗因素水平 mg·L－1

1.2.3 藻細胞計數 取工作曲線(即藻液吸光度值與藻細胞密度之間的線性關系)用的藻液，用722S型可見分光光度計測定出藻液的吸光度值(A420，以不加藻種培養(yǎng)液為空白)，同時用XB－K－25血球計數板計算出相應的藻細胞密度，測定5個梯度，建立起藻液吸光度值與藻細胞密度之間的線性關系，通過測定樣品藻液吸光值即可換算成藻細胞密度.

1.2.4 比生長速率(K)藻細胞的比生長速率(K)通過以下公式計算:K=(lnNt－lnN0)/T，式中，N0為接種時藻細胞的密度(cells·mL－1)，Nt為經過T時間(d)培養(yǎng)后的藻細胞密度(cells·mL－1)，T為藻液培養(yǎng)時間(d).

1.2.5 統(tǒng)計分析 實驗數據先用Excel軟件進行數據處理，然后用SPSS12.0軟件對其進行方差分析.

2 結果與分析

2.1 氮的單因子實驗 實驗結果見圖2，從圖2可知，硝酸鈉、尿素和硫酸銨均可作為氮源，最適合直鏈藻生長的氮鹽為尿素，它以20～30 mg·L－1的質量濃度范圍為最佳;NaNO3-N在10～60 mg·L－1的質量濃度范圍內，氮鹽質量濃度的變化對直鏈藻的生長速率沒有顯著影響;(NH4)2SO4只能使用低于10 mg·L－1的氮鹽質量濃度.經單因素方差分析得知，3種氮鹽對直鏈藻生長的影響均極顯著(P＜0.01).

圖2 氮鹽質量濃度對直鏈藻生長速率的影響

圖3 磷鹽質量濃度對直鏈藻生長速率的影響

2.2 磷的單因子實驗 實驗結果見圖3，從圖3可知，直鏈藻在磷鹽質量濃度為0～4 mg·L－1的范圍內均能生長，最適生長的磷鹽質量濃度為0.5～1 mg·L－1，且以KH2PO4效果最好.經單因素方差分析得知，磷鹽對直鏈藻生長的影響極顯著(P＜0.01).

2.3 鐵的單因子實驗 實驗結果見圖4，從圖4可知，直鏈藻對鐵鹽的需求量很少，經單因素方差分析得知，鐵鹽對直鏈藻的生長有顯著影響 (P＜0.05).

圖4 鐵鹽質量濃度對直鏈藻生長速率的影響

圖5 硅酸鈉質量濃度對直鏈藻生長速率的影響

2.4 硅的單因子實驗 實驗結果見圖5，從圖5可知，在硅鹽質量濃度為5～40 mg·L－1的范圍內均可促進直鏈藻生長，其最適生長的質量濃度范圍為10～20 mg·L－1，經單因素方差分析得知，Na2SiO3對直鏈藻生長的影響極顯著(P＜0.01).

2.5 正交實驗 采用四大營養(yǎng)鹽正交實驗，對直鏈藻的比生長速率(K值)進行直觀分析和方差分析，結果見表2和表3，從表2和表3可以看到，在正交實驗設計中，尿素和磷酸二氫鉀對直鏈藻的生長有極顯著的影響(P＜0.01)，而硅酸鈉、檸檬酸鐵(正交實驗選擇的3個水平)對直鏈藻的生長不顯著 (P＞0.05)，對K值進行直觀分析和方差分析得出，7號組合培養(yǎng)直鏈藻的效果最好，即(NH2)2CO，KH2PO4，FeC6H5O7，Na2SiO3最佳的質量濃度分別為 30，0.5，0.05，10 mg·L－1.

表2 氮、磷、鐵、硅營養(yǎng)鹽的正交實驗結果

表3 正交實驗方差分析結果

3 討論

3.1 氮鹽 氮被稱為生命的元素，在植物體中，氮是蛋白質、核酸、磷脂的主要成分，而這三者又是原生質、細胞核和生物膜的重要組成部分，它們在生命活動中有著特殊作用［12］.通常認為，氮和磷是海洋和淡水生態(tài)系統(tǒng)中限制藻類生長的最普通的營養(yǎng)鹽［13－15］.已有實驗表明，不同種類的單細胞藻能利用不同種類的氮源，對氮鹽的質量濃度要求也不一樣［16］.本實驗結果表明，尿素、硝酸鈉、硫酸銨均能被直鏈藻利用.在實驗設置的質量濃度范圍內，當(NH2)2CO質量濃度為0～30 mg·L－1時，K值隨N質量濃度的增加呈上升趨勢，(NH2)2CO質量濃度范圍為30～60 mg·L－1時，K值隨N質量濃度的增加而緩慢下降;在(NH4)2SO4質量濃度為10～60 mg·L－1的范圍內，K值隨著N質量濃度的升高而降低.當N質量濃度為10 mg·L－1時，硫酸銨的K值為該質量濃度下的3種鹽中的最大值(0.561)，尿素K值為0.557，硝酸鈉K值為0.543;而當N質量濃度為30 mg·L－1時，尿素K值為最大(0.576)，硝酸鈉K值為0.543，硫酸銨K值為最小(0.529).3種氮鹽的最佳N質量濃度各不一樣，其中最適生長的(NH4)2SO4質量濃度為10 mg·L－1，(NH2)2CO 為30 mg·L－1，而 NaNO3質量濃度為10 ～60 mg·L－1范圍內，NaNO3含量的變化對直鏈藻生長的影響沒有顯著差異.當(NH4)2SO4質量濃度大于10 mg·L－1時，隨著氮質量濃度的增加，K值越來越小，這是由于在單細胞藻類的培養(yǎng)過程中，CO2會被藻類吸收而導致培養(yǎng)液的pH值升高，從而致使NH+4易變?yōu)镹H3，并使藻類受到毒害的緣故.

3.2 磷鹽 磷是藻類葉綠體雙層膜、基粒、DNA與ATP的構成成分，它在光合作用的物質轉化中也起著重要的作用，是藻類營養(yǎng)中僅次于氮的元素.實驗結果表明，磷是直鏈藻的一個重要限制因子，2種不同磷鹽對直鏈藻生長繁殖的影響差異不大，其中KH2PO4稍優(yōu)于NaH2PO4.2種磷鹽的質量濃度均以0.5～1 mg·L－1為最好，磷鹽質量濃度在0～1 mg·L－1范圍內，隨著其質量濃度的增加，比生長速率(K)呈上升趨勢.磷鹽質量濃度在2～4 mg·L－1范圍內，隨著其質量濃度的增加，該藻的K值越來越小，說明高質量濃度的磷鹽對直鏈藻的生長有抑制作用，當培養(yǎng)液中磷鹽的質量濃度在5 mg·L－1以上時，培養(yǎng)4 d后藻種全部死亡.

3.3 鐵鹽 鐵是藻類細胞內某些氧化－還原的載體和輔酶的組成成分，缺鐵會影響多種代謝過程，甚至會抑制藻細胞的生長［17］.實驗結果表明，加鐵實驗組的K值明顯比對照實驗組的K值大，這說明鐵是直鏈藻生長繁殖的重要微量元素.鐵鹽質量濃度在0～0.05 mg·L－1的范圍內，隨著其質量濃度的增加比生長速率(K)呈上升趨勢，以0.05 mg·L－1為最佳，其中FeC6H5O7的效果稍優(yōu)于FeSO4.鐵鹽質量濃度在0.05～0.5 mg·L－1的范圍內，隨著其質量濃度的升高，藻細胞的分裂速率越來越小.有研究表明，四爿藻最佳的鐵鹽質量濃度為 0.4 mg·L－1［18］;球等鞭金藻最佳的鐵鹽質量濃度為 0.1 mg·L－1［19］. 本實驗結果表明，直鏈藻對鐵鹽的需求相對較低，高質量濃度的FeC6H5O7和FeSO4對直鏈藻的生長繁殖均有一定的抑制作用.

3.4 硅鹽 硅是硅藻生長繁殖的必需營養(yǎng)元素，它除了作為細胞壁結構成分外，還參與蛋白質、光合色素及DNA合成和細胞分裂等多種代謝和生長過程［20］.實驗結果表明，加硅實驗組藻細胞K值均顯著大于缺硅對照組的藻細胞K值，直鏈藻在硅鹽質量濃度為0～40 mg·L－1的范圍內均能生長繁殖，硅鹽質量濃度在0～5 mg·L－1的范圍內，隨著其質量濃度的增加比生長速率(K)呈直線上升，硅鹽質量濃度在5～15 mg·L－1的范圍內，隨著其質量濃度的增加比生長速率(K)呈緩慢上升趨勢，硅鹽質量濃度為15 mg·L－1時，比生長速率(K)達最大.硅鹽質量濃度在15～40 mg·L－1的范圍內，隨著其質量濃度的增加，藻細胞的比生長速率(K)越來越小.

3.5 正交實驗 在單因子實驗的基礎上，選用最佳的氮、磷、鐵、硅營養(yǎng)鹽種類及其最好的3個質量濃度作為正交實驗的因子及水平，實驗結果見表2，并做方差分析見表3.由表2可知，氮、磷、鐵、硅多因子組合實驗結果與文章中的單因子實驗結果基本一致，僅在某些方面存在一些小差異，如:在正交實驗中最適的磷鹽質量濃度為0.5 mg·L－1，而在單因子實驗中則為0.5～1 mg·L－1;在正交實驗中最適的硅鹽質量濃度為10 mg·L－1，而在單因子實驗中則為10～20 mg·L－1.應該指出:硅酸鈉、檸檬酸鐵所被選擇的3個質量濃度水平均較好地促進了藻細胞的生長(沒有空白對照)，故方差分析結果為不顯著.一般認為，正交實驗結果比單因子實驗結果的可靠性更大.上述差異可能表明，氮、磷、鐵、硅營養(yǎng)鹽的配合比例對單細胞藻的生長速率產生了一定程度的影響，是否如此，尚需要進一步的研究.

4 結論

通過本實驗，直鏈藻在實驗室培養(yǎng)時對各種營養(yǎng)鹽的需求如下:1)硝酸鈉、尿素和硫酸銨均可作為氮鹽，最適直鏈藻生長的氮鹽為尿素，硫酸銨只能用低質量濃度(10 mg·L－1);磷酸二氫鉀和磷酸二氫鈉均可作為磷鹽，其中鉀鹽稍微優(yōu)于鈉鹽;直鏈藻對鐵鹽的需求量很少，檸檬酸鐵和硫酸亞鐵均可作為鐵鹽;硅在直鏈藻的培養(yǎng)中是必須的，培養(yǎng)液中加入硅鹽后能顯著地促進直鏈藻的生長;2)培養(yǎng)直鏈藻的最佳營養(yǎng)鹽［(NH2)2CO，KH2PO4，FeC6H5O7，Na2SiO3］質量濃度配比為 30∶0.5∶0.05∶10.

［1］唐興本，陸波，劉杰.海水育苗優(yōu)質餌料—直鏈藻的培養(yǎng)技術［J］.水產科技情報，2005，32(2):53－56.

［2］路建明，楊家新，吳學軍.微藻及酵母強化輪蟲對河蟹蚤狀幼體的影響［J］.水利漁業(yè)，2004，24(6):69－70.

［3］王慶，唐晟凱，楊家新.直鏈藻強化的輪蟲對中華絨螯蟹蚤狀幼體Ⅱ期與Ⅲ期生長及脂肪酸組成的影響［J］.南京師大學報:自然科學版，2006，29(1):102 －105.

［4］吳學軍，楊家新，姜愛蘭.六株海洋微藻強化的酵母輪蟲對中華絨螯蟹蚤狀幼體的影響［J］.水產養(yǎng)殖，2009，30(10):55－58.

［5］劉德經，朱善央，李正華，等.西施舌的食譜分析［J］.經濟動物報，2009，13(2):95－100.

［6］吳學軍，楊家新，陸建明，等.直鏈藻密度對中華絨螯蟹蚤狀幼體Z1到Z2的影響［J］.淡水漁業(yè)，2004，34(1):32－33.

［7］NOBUTADA NAKAMOTO，MARCOS A MARINS，JOSE G Tundisi.Synchronous growth of a freshwater diatom Melosira italica under natural environment［J］.Oecologia(Berl.)，1976，23(3):179 － 184.

［8］TOLEDO A P P，D'AQUINO'V A，TUNDISI J G.Influence of humic acid on growth and tolerance to cupricions in Melosira italica(subsp.subartica)［J］.Hydrobiologia，1982，87(3):247 －254.

［9］王珺，邢詒炫，陳國華，等.不同生態(tài)因子對直鏈藻生長的影響［J］.熱帶生物學報，2010，1(3):220－223.

［10］成永旭.生物餌料培養(yǎng)學［M］.北京:中國農業(yè)出版社，2005:75.

［11］于貞，王長海.小球藻培養(yǎng)條件的研究［J］.煙臺大學學報:自然科學與工程版，2005，18(3):206－211.

［12］王忠.植物生理學［M］.北京:中國農業(yè)出版社，2000:80－90.

［13］SCHINDLER D W.Evolution of phosphorus limitation inlakes［J］.Science，1977，195(1):260 －262.

［14］WYNNE D，BERMAN T.Hot water extractable phosphorus—an indicator of nutritional status of Peridinium cinctum(Dinophyceae)from Lake Kinneret(Israel)［J］.Phycol，1980，16(1):40 －46.

［15］LEAN D R S，PICK F R.Photosynthetic response of lake plankton to nutrient enrichment:a test for nutrient limitation［J］.Limnol.Oceanog，1981，26(6):1001 －1019.

［16］馬志珍.氮源及其濃度對三角褐指藻生長的影響［J］.海洋湖沼通報，1983(2):45－50.

［17］OPKELLEY J C.Inorganic Nutrients［M］.London:Black Well Scientific Publications，1974:610 －633.

［18］王珺，王永波，陳國華，等.四爿藻培養(yǎng)條件的研究［J］.海洋漁業(yè)，2008，30(2):189 －194.

［19］王珺，李紅，王嫣，等.鞭金藻3011的生長及其營養(yǎng)鹽關系的研究［J］.海南大學學報:自然科學版，2002，20(4):319－323.

［20］WERNER D.Silicate Metabolism［M］.London:Black Well Scientific Publications，1977:110 －149.