李云龍， 李 霞， 梁鐵雙， 張立國， 李冬冬

（1.北京市植物保護(hù)站，北京 100029；2.安達(dá)市農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心，安達(dá) 151400；3.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院玉米研究所，哈爾濱 156104；4.饒河出入境檢驗(yàn)檢疫局，饒河 155700）

亞洲小車蝗（OedaleusasiaticusB.－Bienko）屬直翅目（Orthoptera）蝗總科（Acridoidea）絲角蝗科（Oedipodidae）小車蝗屬（Oedaleus），主要分布于河北、內(nèi)蒙古、甘肅和青海省等地，是我國北方草原的主要優(yōu)勢種害蟲，也是農(nóng)牧交錯地帶的重要經(jīng)濟(jì)害蟲［1］。亞洲小車蝗具有遠(yuǎn)距離遷移的特性，遷移時間主要集中在晚上20：00至凌晨03：00期間，同時由于其具有較強(qiáng)的趨光性，因而在城市中燈光強(qiáng)烈的地方則吸引大量的亞洲小車蝗成蟲［2］。2000年和2002年的7月上旬至8月上旬，北京市區(qū)及區(qū)縣城區(qū)夜間燈下突然出現(xiàn)大量亞洲小車蝗成蟲，給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成嚴(yán)重?fù)p失的同時，還給市民正常生活帶來極大不便，造成了一定程度的社會恐慌。利用現(xiàn)代技術(shù)手段開展種群遺傳關(guān)系及遷移來源研究，對于做到蟲源地早監(jiān)測、早預(yù)警、早防治，降低蟲源地害蟲基數(shù)，提高監(jiān)測預(yù)警水平，提高防控工作的主動性、及時性和有效性，具有重要意義。

線粒體DNA序列分析（mtDNA sequence analysis）技術(shù)是目前進(jìn)行昆蟲種群遺傳研究中最常用的分子生物學(xué)技術(shù)之一。mtDNA中常用的序列分析目的基因主要有12S RNA、16S RNA、COI、COII、ND1、ND 6和Cytb基因等，其中細(xì)胞色素氧化酶I基因（COI基因）已被成功用于橘小實(shí)蠅等遷飛性昆蟲的種群遺傳結(jié)構(gòu)的研究［3－6］。高書晶等也利用COI基因?qū)?nèi)蒙古地區(qū)7個不同地理種群的亞洲小車蝗樣本進(jìn)行了遺傳多樣性和種群關(guān)系初步分析［7］。

本研究在收集不同地理種群亞洲小車蝗成蟲樣品的基礎(chǔ)上，采用mt DNA COI基因序列分析技術(shù)，研究北京及周邊地區(qū)亞洲小車蝗的種群遺傳關(guān)系，為進(jìn)一步確定北京地區(qū)亞洲小車蝗的遷移來源，做到蟲源地提早防治提供分子生物學(xué)方面的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試亞洲小車蝗樣本包括內(nèi)蒙古自治區(qū)的錫林郭勒盟、赤峰市、烏蘭察布市，河北省的張家口市、承德市和北京的密云縣共3個省（直轄市）、6個盟市縣在內(nèi)的共7個地理種群的139個樣本（表1和圖1），所有樣本均在2011年人工采集，采集的新鮮樣品置于無水乙醇中，－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 用于mtDNA研究的亞洲小車蝗樣本Table 1 Specimens of Oedaleus asiaticus for mt DNA analysis

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 DNA提取與測序

采用天根生化科技（北京）有限公司的“血液／細(xì)胞／組織基因組DNA提取試劑盒”進(jìn)行亞洲小車蝗總DNA的提取，并采用水平瓊脂糖凝膠電泳檢測的方法對所提取的DNA質(zhì)量進(jìn)行檢測。目的片段擴(kuò)增所用特異引物為“Uea7O.a”（5′－TCTCAACAAATCATAAGGACATTGG－3′）和 “Uea10O.a”（5′－TATACTTCTGGGTGTCCAAAGAATCA－3′）［8］。

PCR擴(kuò)增體系為50μL，包括滅菌雙蒸水30.5μL；10× Buffer 8 μL；d NTP（25 mmol／L）3 μL；20μmol／L引物各2μL，模板 DNA（20～50 ng）3μL；TaqPlus DNA聚合酶（2 U／μL）1.5μL。擴(kuò)增條件共35個循環(huán)，包括94℃預(yù)變性3 min，94℃變性1 min，57.5℃ 退火1 min，72℃ 延伸1 min；最后72℃延伸30 min，4℃保存?zhèn)溆谩CR粗產(chǎn)物的純化和測序，委托北京奧科生物技術(shù)公司在ABI－3730測序儀上完成，所有序列采用雙向測序以確保測序的準(zhǔn)確性。

1.2.2 數(shù)據(jù)分析

序列的比對和剪切利用Clustal X（Version 1.83）軟件完成；堿基組成及單倍型分析利用 Mega version 3.1軟件［10］完成；種群遺傳分化系數(shù)（FST）、分子方差（AMOVA）分析［8］和 Mantel檢測［9］等使用 Arlequin 3.0軟件［8］完成；單倍型多樣性、核苷酸多樣性（π）、平均核苷酸差異數(shù)（k）及其相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)偏差（SD）等參數(shù)分析使用 DNASP 4.10.1軟件［11］完成；單倍型的統(tǒng)計(jì)簡約網(wǎng)絡(luò)（statistical parsimony）使用TCS version 1.21軟件［12］進(jìn)行構(gòu)建，并根據(jù)Pfenninger和 Posada［13］提出的頻率判據(jù)（frequency criterion）、拓?fù)渑袚?jù)（topological criterion）和地理判據(jù)（geographic criterion）原則進(jìn)行斷環(huán)（break the loops），以解決在統(tǒng)計(jì)簡約網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建過程中出現(xiàn)的分支、關(guān)聯(lián)等問題，在進(jìn)行斷環(huán)過程中始終選擇最簡約的解決方案。

2 結(jié)果與分析

2.1 堿基組成分析

在所有樣品中最終獲得準(zhǔn)確一致的長為645 bp的線粒體DNA CO I基因部分序列139條，全部樣本序列中A、T、G和C堿基平均含量分別為34.9%、31.0%、16.1%和18.0%，A＋T 的平均含量為65.9%，明顯高于G＋C的平均含量34.1%。在645個堿基中僅檢測到12個多態(tài)性位點(diǎn)，占堿基總數(shù)的1.86%，其中多數(shù)變異發(fā)生在密碼子的第3位點(diǎn)上，占變異位點(diǎn)的50%，發(fā)生在第1位點(diǎn)的變異比例為33.3%，第2位點(diǎn)最少，占變異比例的16.7%。12個多態(tài)性位點(diǎn)中包括7個單變異多態(tài)性位點(diǎn)和5個簡約信息位點(diǎn)，在堿基的替換中，5個位點(diǎn)發(fā)生了轉(zhuǎn)換，6個位點(diǎn)發(fā)生了顛換，1個位點(diǎn)同時發(fā)生了轉(zhuǎn)換和顛換，所有多態(tài)性位點(diǎn)全部由堿基的替換產(chǎn)生，未發(fā)現(xiàn)插入和缺失。

2.2 遺傳多樣性分析

亞洲小車蝗7個地理種群的核苷酸多樣性（π）、平均核苷酸差異數(shù)（K）以及單倍型多樣性（Hd）參數(shù)值見表2。供試亞洲小車蝗樣本總體上表現(xiàn)出較低水平的核苷酸多樣性（0.000 42）和單倍型多樣性（0.205）。核苷酸多樣性最高的種群為內(nèi)蒙古赤峰廣興源種群（0.000 84），其次分別是內(nèi)蒙古烏蘭察布種群（0.000 69）、內(nèi)蒙古赤峰達(dá)萊諾日種群（0.000 41）和內(nèi)蒙古錫林郭勒種群（0.000 12），河北張家口種群、河北承德種群和北京密云種群均未發(fā)生遺傳變異，核苷酸多樣性均為0。與上述核苷酸多樣性高低排序相比，內(nèi)蒙古烏蘭察布種群的單倍型多樣性在7個種群中最高（0.338），其次分別為內(nèi)蒙古赤峰廣興源種群（0.335）、內(nèi)蒙古赤峰達(dá)萊諾日種群（0.251）和內(nèi)蒙古錫林郭勒種群（0.080）。

在139條序列中共鑒定出13種單倍型，其中共享單倍型僅4種，其余9種均為獨(dú)享單倍型。在4種共享單倍型中，單倍型H3為內(nèi)蒙古赤峰達(dá)萊諾日種群內(nèi)共享；其余3種單倍型在至少2個種群間共享，分別是H1在所有7個種群中共享，H2在內(nèi)蒙古赤峰達(dá)萊諾日種群和內(nèi)蒙古錫林郭勒種群間共享，H7在內(nèi)蒙古赤峰廣興源種群和內(nèi)蒙古烏蘭察布種群間共享。H4、H5、H6、H8、H9、H10、H11、H12、H13共9個獨(dú)享單倍型的存在，表明在各種群內(nèi)存在一定的遺傳分化（表3）。

表2 亞洲小車蝗7個地理種群樣本的遺傳分化系數(shù)F ST、基因流N m以及遺傳多樣性參數(shù)1）Table 2 Genetic differentiation coefficient（F ST），gene flow （N m）and parameters of genetic diversity in population of O.asiaticus

表3 各種群單倍型數(shù)量、頻率及在2個以上種群間共享的單倍型Table 3 The number and frequency of haplotypes in 7 populations and the haplotype shared by at least two populations

2.3 種群遺傳結(jié)構(gòu)

種群遺傳分化系數(shù)FST（F－statistic）和基因流（gene flow）是反映種群間的遺傳分化程度和各種群間基因交流情況的重要指標(biāo)［14］。表2可示，各種群間遺傳分化系數(shù)（FST）在0.013 77和－0.107 01之間，差異均未達(dá)到顯著程度（P＞0.05）。FST最高值出現(xiàn)在內(nèi)蒙古赤峰達(dá)萊諾日種群與內(nèi)蒙古赤峰廣興源種群之間（0.013 77），其次是內(nèi)蒙古赤峰達(dá)萊諾日種群與內(nèi)蒙古烏蘭察布種群（0.008 93）、內(nèi)蒙古赤峰廣興源種群與內(nèi)蒙古錫林郭勒種群（0.004 37）、內(nèi)蒙古烏蘭察種群與內(nèi)蒙古錫林郭勒種群（0.003 19）；河北張家口、河北承德和北京密云3個種群間的FST值均為0，其余種群間的遺傳分化系數(shù)均為負(fù)值，表明這些種群間的遺傳分化程度均較小。

各種群間基因流在156.239 8和－265.05之間，差異也均未達(dá)到顯著程度。同為內(nèi)蒙古赤峰市的達(dá)萊諾日種群與廣興源種群之間的基因流為35.810 82，均低于內(nèi)蒙古烏蘭察種群與內(nèi)蒙古錫林郭勒種群（156.239 8）、內(nèi)蒙古赤峰廣興源種群與內(nèi)蒙古錫林郭勒種群（113.916 476）、內(nèi)蒙古赤峰達(dá)萊諾日種群與內(nèi)蒙古烏蘭察布種群（55.491 04）。其余各種群間的基因流的絕對值也都大于4，表明種群間的基因流動比較頻繁［14］。

依據(jù)各種群的地理空間特征，將供試種群劃分為6個群組：1）內(nèi)蒙古錫林郭勒；2）內(nèi)蒙古赤峰廣興源種群和內(nèi)蒙古赤峰達(dá)萊諾日種群；3）內(nèi)蒙古烏蘭察布種群；4）河北張家口種群；5）河北承德種群；6）北京密云種群。對其進(jìn)行AMOVA分析，發(fā)現(xiàn)種群間變異占－6.47%，組內(nèi)種群間變異占了4.48%，種群個體間變異占了101.99%，結(jié)果表明引起種群總體變異的主要因素還是種群內(nèi)的個體間變異。

通過對地理種群FST值（表2）和Nei氏遺傳距離（Nei氏平均核苷酸差異數(shù)）與各種群間空間距離間（表4）的Mantel test結(jié)果表明，2對矩陣之間不存在顯著的相關(guān)性（R1＝－0.275 888，P1＝0.857 000；R2＝－0.014 366，P2＝0.453 000），即亞洲小車蝗種群間的遺傳分化程度與地理距離沒有顯著的相關(guān)性。

2.4 單倍型網(wǎng)絡(luò)分析

研究鑒定出的13個單倍型中，核心單倍型H1被所有7個種群的124個個體所共享，占樣本總量的89.2%。內(nèi)蒙古錫林郭勒（A）種群與內(nèi)蒙古赤峰達(dá)萊諾日（C）共享H2；內(nèi)蒙古赤峰廣興源（B）種群共鑒定出7個單倍型，分別獨(dú)享H5、H6、H7、H8、H9和H10共6個單倍型，其中單倍型H9由核心單倍型H1經(jīng)過3次突變形成，并且前兩次的中間單倍型缺失；H8由H1經(jīng)過1次突變形成單倍型H5，再由其經(jīng)過1次突變形成；內(nèi)蒙古赤峰達(dá)萊諾日（C）種群獨(dú)享H3、H4，并與A共享H2；內(nèi)蒙古烏蘭察布（D）種群分別獨(dú)享H11、H12和H13；河北張家口（E）、河北承德（F）和北京密云（G）種群29個樣本的序列全部相同，僅鑒定出一種單倍型。整體上，各單倍型之間未形成與其地理種群空間位置相對應(yīng)的聚類單元，與上述各地理種群FST值、Nei氏遺傳距離與各種群間空間距離間的Mantel test結(jié)果一致。同時，在單倍型網(wǎng)絡(luò)進(jìn)化圖中也未發(fā)現(xiàn)各單倍型之間存在明顯的進(jìn)化關(guān)系，僅在內(nèi)蒙古赤峰廣興源（B）種群中分別存在一定的變異分化，該種群的遺傳變異程度相對較高。

表4 7個地理種群間的Nei氏遺傳距離和地理距離1）Table 4 Nei’s genetic distances and geographic distances between 7 populations of O.asiaticus

圖1 單倍型最大簡約網(wǎng)絡(luò)進(jìn)化圖Fig.1 Network showing the most parsimonious evolutionary relationships among haplotypes

3 討論

亞洲小車蝗mt DNA COI基因序列全長為1 541 bp［15］，本研究用于分析的645 bp序列位于第47位堿基至第704位堿基之間，僅檢測到12個多態(tài)性位點(diǎn)，占所測核苷酸的1.86%，樣本總體核苷酸多樣性僅為0.000 42。而高書晶等2011年所用473 bp序列位于第250位堿基至第723位堿基之間，共檢測到29個核苷酸變異位點(diǎn)，占所測核苷酸的6.13%；在截取第250位堿基至第704位堿基之后，在454個堿基中仍鑒定出27個核苷酸變異位點(diǎn)，占所測核苷酸的5.95%。本研究所用樣本，除內(nèi)蒙古地區(qū)的4個種群外，還有河北省和北京市的3個種群，而且所用分析序列，較高書晶等2011年截取后454 bp序列多出203 bp，但本研究樣本的多態(tài)性位點(diǎn)檢出率僅為1.86%，遠(yuǎn)低于后者的5.95%，這可能是由于本研究中的實(shí)驗(yàn)樣本均由同一年采集，并且亞洲小車蝗具備較強(qiáng)的飛翔能力，致使各種群之間存在著廣泛的基因交流和融合造成的。

在本研究中，出現(xiàn)單倍型數(shù)量最多的種群是內(nèi)蒙古赤峰廣興源種群，共檢測出7種單倍型，這可能與該種群的樣品數(shù)量最多有關(guān)；但同時，該種群的核苷酸多樣性為0.000 84，也是所有種群中核苷酸多樣性最高的種群。核苷酸多樣性是由每個群體內(nèi)各個單元型的兩兩配對差異的平均值得出，不依賴于樣本大小和序列長度，是進(jìn)行遺傳座位或群體間遺傳變異程度比較的理想指標(biāo)。赤峰市的克什克騰旗是內(nèi)蒙古草原地區(qū)亞洲小車蝗的主要分布區(qū)之一。在內(nèi)蒙古赤峰廣興源地區(qū)的西北方向，分布著達(dá)里諾爾湖、崗更諾爾湖以及其他的一些面積較小的湖泊和濕地，這些水源地周邊植被豐富，溫濕度適宜，為亞洲小車蝗提供了較為充足的食物和生長發(fā)育條件。內(nèi)蒙古赤峰廣興源種群遺傳多樣性較高，可能與該地區(qū)生長條件適宜，種群數(shù)量較大有關(guān)。

在本研究139個樣本中，僅鑒定出13個單倍型，單倍型檢出率為9.35%，樣本總體單倍型多樣性僅為0.205，各單倍型之間未形成與其地理種群空間位置相對應(yīng)的聚類單元；同時，在單倍型網(wǎng)絡(luò)進(jìn)化圖中也未發(fā)現(xiàn)各單倍型之間存在明顯的進(jìn)化關(guān)系。高書晶等2011年的研究結(jié)果也表明，亞洲小車蝗mtDNA COI序列不同單倍型之間有一定的分歧，形成不同的簇類關(guān)系，但總體上看，這種簇類關(guān)系基本上呈平行分布，沒有明顯的地域性差別。兩次結(jié)果表明，mt DNA COI基因雖然成功用于橘小實(shí)蠅等遷飛性昆蟲的種群遺傳結(jié)構(gòu)研究，但在亞洲小車蝗種類種群遺傳關(guān)系的研究中表現(xiàn)卻不理想，表明同一種目的基因的進(jìn)化速率，在不同物種間存在著較大的差異。關(guān)于不同地區(qū)間亞洲小車蝗的遷移規(guī)律研究，還有待于選擇進(jìn)化速率更快的遺傳標(biāo)記來進(jìn)行進(jìn)一步研究，并適當(dāng)擴(kuò)大研究種群的樣本數(shù)量。

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