馮玉康，趙伯友，姜國(guó)志

(神威藥業(yè)集團(tuán)有限公司，河北 石家莊 051430)

中藥工業(yè)

響應(yīng)曲面法優(yōu)化黃芩苷精制工藝研究

馮玉康*，趙伯友，姜國(guó)志

(神威藥業(yè)集團(tuán)有限公司，河北 石家莊 051430)

目的：以黃芩苷粗品為原料，利用響應(yīng)曲面法優(yōu)化黃芩苷的精制工藝以得到較高純度的黃芩苷。方法：在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，應(yīng)用Box-Behnken設(shè)計(jì)方法建立數(shù)學(xué)模型，選擇乙醇濃度、pH值、保溫時(shí)間和保溫溫度為影響因子，以黃芩苷純度為響應(yīng)值，進(jìn)行響應(yīng)曲面分析。結(jié)果：確定黃芩苷的最佳精制工藝條件為：乙醇濃度50%，pH值2.00，保溫溫度80 ℃，保溫時(shí)間45 min。在最佳精制工藝條件下黃芩苷的平均純度為91.13%。結(jié)論：精制工藝與模型高度擬合，可以用于工業(yè)生產(chǎn)。

黃芩苷；響應(yīng)曲面法；精制工藝；純度

黃芩為唇形科植物黃芩ScutcllariabaicalensisGeorgi的干燥根，作為清熱解毒的常用中藥。其主要有效成分為黃酮類化合物，迄今已分離出約40種黃酮類物質(zhì)[1]。其中，黃芩苷是主要的有效成分，具有顯著的生物活性。它具有清熱、降壓、鎮(zhèn)靜、利尿、利膽、抗過(guò)敏、抗炎、抗心律失常、抗動(dòng)脈硬化、防紫外線、抗癌、抗氧化、清除異菌等功效[2-5]。但是現(xiàn)在制藥企業(yè)使用的黃芩苷的純度較低，口服制劑的純度只有83%，這就可能產(chǎn)生潛在的用藥危險(xiǎn)。為了盡量避免這些危害，本研究主要是利用響應(yīng)曲面法優(yōu)化黃芩苷的精制工藝，使黃芩苷達(dá)到更高的純度，從而提高黃芩苷的用藥安全性。

1 材料與儀器

1.1 材料

黃芩苷粗品購(gòu)買于諸城市浩天藥業(yè)有限公司(含量為83%，用于口服制劑)。

1.2 試藥

黃芩苷對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110715-201117，純度：91.7%)。

乙醇，分析純(天津市申泰化學(xué)試劑有限公司)；乙醇，色譜純(Thermo Fisher)；氫氧化鈉，分析純(天津市申泰化學(xué)試劑有限公司)；鹽酸，藥用輔料(湖南爾康制藥股份有限公司)。

1.3 儀器

METTLER-ALC-210.4電子分析天平(上海梅特勒托利多儀器有限公司)；UltiMate3000高效液相色譜儀(美國(guó)戴安公司)。HH-SB型電熱恒溫水浴鍋(科偉儀器)；five easy系列FE20pH計(jì)(上海梅特勒托利多儀器有限公司)；SHB-III循環(huán)水式真空泵(鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司)；KH3200E型超聲清洗器(昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司)。

2 方法

2.1 黃芩苷的精制

取黃芩苷粗品若干，加10倍量的純化水?dāng)嚢璩苫鞈乙海觅|(zhì)量濃度為20%的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至7.00，加入適量的乙醇，靜置過(guò)夜后，抽濾，棄去沉淀。濾液用2 mol·L-1的鹽酸調(diào)節(jié)pH值，于不同的水浴溫度下保溫一段時(shí)間，靜置冷卻至室溫后，抽濾。濾餅依次用適量的純化水，50%的乙醇溶液和95%的乙醇溶液洗滌至洗滌液pH=4.00左右時(shí)即可。將濾餅置于60 ℃的真空干燥箱真空干燥4 h即得精制品。

2.2 黃芩苷標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

取黃芩苷對(duì)照品25 mg，精密稱定，置250 mL容量瓶中，加70%乙醇適量使溶解，再加70%乙醇稀釋至刻度，搖勻，得100 μg·mL-1的黃芩苷對(duì)照品溶液。將對(duì)照品溶液稀釋為10，20，30，40，50，100 μg·mL-1，各取10 μL進(jìn)液相色譜儀檢測(cè)，以黃芩苷濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)繪制黃芩苷標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為Y=33.87X-36.564，r=0.999 9。

2.3 黃芩苷含量測(cè)定方法[6]

2.3.1 色譜條件和系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以甲醇-水-磷酸(47∶53∶0.2)為流動(dòng)相，檢測(cè)波長(zhǎng)為276 nm。理論板數(shù)按黃芩苷峰計(jì)算應(yīng)不低于3 000。

2.3.2 對(duì)照品溶液的制備 取黃芩苷對(duì)照品適量，精密稱定，置100 mL量瓶中，加70%乙醇適量使溶解，加流動(dòng)相1 mL，再加70%乙醇稀釋至刻度，搖勻；精密量取5 mL，置10 mL量瓶中，加70%乙醇稀釋至刻度，搖勻，即得(每1 mL中含黃芩苷50 μg)。

2.3.3 供試品溶液的制備 取本品10 mg，精密稱定，置100 mL量瓶中，加70%乙醇適量使溶解，加流動(dòng)相1 mL，再加70%乙醇稀釋至刻度，搖勻；精密量取5 mL，置10 mL量瓶中，加70%乙醇稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.3.4 測(cè)定方法 分別精密吸取對(duì)照品溶液與供試品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，測(cè)定，即得。

2.4 單因素實(shí)驗(yàn)

2.4.1 乙醇濃度 精制過(guò)程中設(shè)定鹽酸調(diào)節(jié)的pH值為2.00，保溫溫度設(shè)定為80 ℃，保溫時(shí)間設(shè)定為30 min，乙醇的濃度依次調(diào)節(jié)為40%、50%、60%、70%。依2.1進(jìn)行精制，樣品按2.3測(cè)定。

2.4.2 pH值 精制過(guò)程中設(shè)定乙醇的濃度為50%，保溫溫度設(shè)定為80 ℃，保溫時(shí)間設(shè)定為30 min，鹽酸調(diào)節(jié)的pH值依次調(diào)節(jié)為1.00，2.00，3.00，4.00。按2.1進(jìn)行精制，樣品按2.3測(cè)定。

2.4.3 保溫溫度 精制過(guò)程中設(shè)定乙醇的濃度為50%，鹽酸調(diào)節(jié)的pH值設(shè)定為2.00，保溫時(shí)間設(shè)定為30 min，保溫溫度依次調(diào)節(jié)為60，70，80，90 ℃。按2.1進(jìn)行精制，樣品按2.3測(cè)定。

2.4.4 保溫時(shí)間 精制過(guò)程中設(shè)定乙醇的濃度為50%，鹽酸調(diào)節(jié)的pH值設(shè)定為2.00，保溫溫度設(shè)定為80 ℃，保溫時(shí)間依次調(diào)節(jié)為15，30，45，60 min。按2.1進(jìn)行精制，樣品按2.3測(cè)定。

2.5 響應(yīng)曲面試驗(yàn)

在單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Behnken的中心組合設(shè)計(jì)原理設(shè)計(jì)自變量，以黃芩苷純度為響應(yīng)值，通過(guò)響應(yīng)曲面分析(Response Surface Analysis，RSA)進(jìn)行黃芩苷精制工藝條件的優(yōu)化。

2.6 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

利用響應(yīng)曲面軟件分析所得的最佳實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行3次試驗(yàn)，分別測(cè)定黃芩苷的純度，得到黃芩苷的實(shí)際平均純度，并計(jì)算與模型給出的理論值的相對(duì)偏差。

3 結(jié)果與分析

3.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

單因素實(shí)驗(yàn)對(duì)黃芩苷精制效果的影響趨勢(shì)如圖1所示。

A.乙醇溶液濃度 B.pH值 C.保溫溫度 D.保溫時(shí)間圖1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1.1 乙醇濃度對(duì)精制黃芩苷純度的影響 由圖1A可以看出，乙醇含量為50%時(shí)黃芩苷的純度最高，分析原因?yàn)辄S芩苷類物質(zhì)在形成鈉鹽后溶于50%的乙醇溶液，不能溶解于該溶液的雜質(zhì)就會(huì)析出。乙醇濃度低，脂溶性雜質(zhì)析出增加，乙醇濃度高，水溶性雜質(zhì)析出升高。選用50%的乙醇濃度能很好地除去水溶性和脂溶性的雜質(zhì)。

3.1.2 pH值對(duì)精制黃芩苷純度的影響 由圖1B可以看出，黃芩苷的純度隨著pH值的升高而出現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，這和潘燕[7]研究的結(jié)果相符，分析原因?yàn)辄S芩苷具有多酚羥基結(jié)構(gòu)，性質(zhì)不穩(wěn)定，易被氧化，且在酸性條件(pH<2.00)下可發(fā)生一定程度的氧化或水解，從而使得黃芩苷的純度降低。

3.1.3 保溫溫度對(duì)精制黃芩苷純度的影響 由圖1C可以看出，黃芩苷的純度保溫溫度的升高而出現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，分析原因?yàn)楸販囟戎皇谴龠M(jìn)黃芩苷鈉鹽向著黃芩苷轉(zhuǎn)變，保溫溫度的升高加速了反應(yīng)的速度，在較短時(shí)間內(nèi)水解和氧化的破壞較低，溫度對(duì)純度的影響也就降低到了最低。綜合考慮，選擇80 ℃為最佳的保溫溫度。

3.1.4 保溫時(shí)間對(duì)精制黃芩苷純度的影響 由圖1D可以看出，黃芩苷的純度在保溫時(shí)間45 min后增加變緩，進(jìn)入平臺(tái)期，分析原因?yàn)殡S著時(shí)間的增加，少部分的黃芩苷在長(zhǎng)時(shí)間的加熱和酸性條件下出現(xiàn)了水解和氧化。綜合考慮選用45 min為最佳保溫時(shí)間，這樣既能使得黃芩苷的反應(yīng)完全，而且黃芩苷的損失也相對(duì)減少，純度也能得到很好的保障。

3.2 精制工藝的響應(yīng)面法優(yōu)化

3.2.1因素選擇 根據(jù)Box-Behnken的中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，綜合單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選取乙醇濃度X1、溶液pH值X2、保溫時(shí)間X3和保溫溫度X4對(duì)黃芩苷精制純度率影響顯著的4個(gè)因素，用Y表示黃芩苷的純度，在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上采用4因素3水平的響應(yīng)曲面分析法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，因素與水平選擇見(jiàn)表1。

表1 中心組合實(shí)驗(yàn)因素和水平

3.2.2 響應(yīng)曲面試驗(yàn) 利用Design-Expert8.0.6軟件進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)。本次試驗(yàn)共含有27個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)，其中24個(gè)為析因點(diǎn)，3個(gè)為零點(diǎn)。析因點(diǎn)為自變量取值在所構(gòu)成的三維頂點(diǎn)，零點(diǎn)為區(qū)域的中心點(diǎn)，其中零點(diǎn)試驗(yàn)重復(fù)3次，用以估算試驗(yàn)誤差。Box-Behnken實(shí)驗(yàn)方案及結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 響應(yīng)曲面法實(shí)驗(yàn)方案及結(jié)果

3.3 模型的建立及其顯著性檢驗(yàn)

利用Design-Expert8.0.6軟件對(duì)表2試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得到黃芩苷純度(Y)對(duì)乙醇濃度(X1)、pH值(X2)、保溫時(shí)間(X3)和保溫溫度(X4)二次多項(xiàng)回歸模型為：

對(duì)該模型進(jìn)行方差分析，得出回歸模型系數(shù)顯著性檢驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 響應(yīng)曲面二次回歸方程方差分析

注：*P<0.05，**P<0.01

由表3響應(yīng)曲面二次回歸方程方差分析結(jié)果可知，試驗(yàn)所選模型P<0.000 1，表明回歸模型極其顯著，失擬項(xiàng)P=0.549 5>0.05表明差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明數(shù)據(jù)中沒(méi)有異常點(diǎn)，不需要引入更高次數(shù)的項(xiàng)，校正擬合系數(shù)(Adj R-Squared)為0.897 3，表明響應(yīng)值(黃芩苷純度)變化的89.73%來(lái)自于所選變量。

說(shuō)明該模型擬合程度良好，試驗(yàn)誤差小，信噪比(Adeq Precision)為15.604，大于4，這些充分證明可用此模型來(lái)分析和預(yù)測(cè)精制黃芩苷工藝的結(jié)果[8]。

模型系數(shù)顯著性檢驗(yàn)結(jié)果可知，模型的一次項(xiàng)A、B、C達(dá)到顯著水平(P<0.05)，其中B(P<0.01)對(duì)黃芩苷精制的線性效應(yīng)顯著，二次項(xiàng)A2、B2和D2達(dá)到顯著水平(P<0.05)，其中A2、B2(P<0.01)，對(duì)黃芩苷精制的曲面效應(yīng)顯著，交互項(xiàng)BC都達(dá)到極顯著水平(P<0.01)，交互作用顯著。由此可知，在本試驗(yàn)設(shè)計(jì)范圍內(nèi)，乙醇濃度、pH值、保溫時(shí)間這3個(gè)因素對(duì)黃芩苷精制的線性效應(yīng)和曲面效應(yīng)都顯著，且pH和保溫時(shí)間之間有較強(qiáng)的交互作用。

3.4 響應(yīng)曲面分析

圖2 Y=f(A，B)的響應(yīng)曲面和等高線

根據(jù)曲面模型模擬出的等高線和曲面，考察模型的擬合程度，分析各個(gè)因素對(duì)黃芩苷精制過(guò)程的影響程度，交互作用的模擬等高線和曲面圖中發(fā)現(xiàn)AC，AD，BD，CD的等高線和曲面圖AB(見(jiàn)圖2)相似，等高線的形狀為圓形，表示交互效應(yīng)較弱，而這一點(diǎn)也可以從響應(yīng)曲面二次回歸方程方差分析表中得到印證。AB，AC，AD，BD，CD的P值均大于0.05，屬于交互作用不明顯。而B(niǎo)C的等高線和曲面如圖3所示，等高線為橢圓形，表示交互效應(yīng)顯著，從響應(yīng)曲面二次回歸方程方差分析表的P值也得到印證。結(jié)合表3分析得出結(jié)論，各個(gè)因素對(duì)黃芩苷精制工藝的影響程度關(guān)系為B(pH值)>C(保溫時(shí)間)>A(乙醇濃度)>D(保溫溫度)。

圖3 Y=f(B，C)的響應(yīng)曲面和等高線

3.5 響應(yīng)曲面優(yōu)化黃芩苷精制工藝條件

利用Design-Expert 8.0.6軟件，預(yù)測(cè)的黃芩苷精制最佳工藝為：乙醇濃度51.58%，pH值2.18，保溫時(shí)間43.45 min，保溫溫度81.60 ℃。在最佳精制工藝條件下，黃芩苷的理論最高純度可以達(dá)到91.461 4%。

3.6 響應(yīng)曲面模型的驗(yàn)證

為了全面檢驗(yàn)響應(yīng)曲面優(yōu)化精制黃芩苷工藝所得結(jié)果的可靠性，同時(shí)為了配置和計(jì)時(shí)方便，將提取工藝參數(shù)調(diào)整為：乙醇濃度50%，pH值2.00，保溫時(shí)間45 min，保溫溫度80 ℃，并在此條件下連續(xù)進(jìn)行了3次實(shí)驗(yàn)，黃芩苷的純度經(jīng)檢測(cè)分別為91.10%，91.05%和91.25%，平均值為91.13%，RSD=0.1%。結(jié)果表明基于響應(yīng)曲面法所得的優(yōu)化提取條件準(zhǔn)確可靠。

4 結(jié)論

利用軟件Design-Expert 8.0.6軟件，通過(guò)響應(yīng)曲面分析，得到了各因素的最佳值：乙醇濃度為50%，pH值為2.00，保溫時(shí)間為45 min，保溫溫度為80 ℃。驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，黃芩苷精制所得的平均純度為91.13%。實(shí)驗(yàn)為黃芩苷精制工藝提供了技術(shù)支持，也使制藥企業(yè)生產(chǎn)注射用黃芩苷原料質(zhì)量得到提升，降低了黃芩苷的用藥風(fēng)險(xiǎn)。

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StudyonOptimizationofExperimentalConditionsofBaicalinPurificationTechniquebyResponseSurfaceMethodology

FENG Yu-kang*，ZHAO Bo-you，JIANG Guo-zhi

(ShinewayPharmaceuticalGroupCo.Ltd.，Shijiazhuang051430，China)

Objective：In order to get higher purity baicalin from Baicalin crude，Response Surface Methodology(RSM)is employed to optimize experimental conditions of baicalin purification.Methods：Based on the single factor experiments，Box-Behnken design was applied to establish the mathematical model.The optimum purification process was investigated by response surface methodology with ethanol concentration，pH value，holding temperature and holding time as influencing factors，and the product purity of baicalin was considered as index.Results：The results of RSM suggested the best experimental conditions were：ethanol concentration 50%，pH value 2.00，holding temperature 80 ℃，holding time 45 min.The average product purity of baicalin was 91.13% under above conditions.Conclusion：The optimum purification process was in good agreement with the predicted counterpart，and can be used for industrial production

Baicalin； Response Surface Methodology(RSM)； Refining technology； Purity

2012-11-10)

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馮玉康，E-mail：science123@yahoo.cn