金鋒，張振凌*，任玉珍，陳彥琳，杜杰，周林，白宗利，梁煥

(1.河南中醫(yī)學院，河南 鄭州 450008；2.中國藥材公司，北京 102600)

紫外分光光度法測定巴豆中總生物堿的含量△

金鋒1，張振凌1*，任玉珍2*，陳彥琳2，杜杰2，周林2，白宗利2，梁煥2

(1.河南中醫(yī)學院，河南 鄭州 450008；2.中國藥材公司，北京 102600)

目的：建立紫外分光光度法測定巴豆中總生物堿含量的方法。方法：采用紫外分光光度法，以巴豆苷為對照，在292nm波長處進行含量測定。結(jié)果：巴豆苷在3.84～23.04μg·mL-1與吸光度呈良好的線性關(guān)系，回歸方程Y＝0.036 5X-0.029 7，r＝0.999 9(n＝6)，平均加樣回收率為101.38％，RSD＝1.21％。結(jié)論：本測定方法準確、簡單、靈敏、快速、重現(xiàn)性好，可以作為控制巴豆及巴豆霜質(zhì)量的方法與指標。

巴豆；總生物堿；含量測定；紫外分光光度法

巴豆為大戟科喬木植物巴豆Croton tiglium L.的干燥成熟果實，主產(chǎn)于四川、廣西、云南、貴州等地，為較常用川產(chǎn)道地中藥材。生巴豆味辛、性熱，有大毒，歸胃、大腸經(jīng)，外用蝕瘡，內(nèi)服多制霜用，具有峻下積滯，逐水消腫，豁痰利咽的功能[1]。巴豆主要含有機酸及甘油酯類成分、生物堿類成分及植物蛋白類成分，其中，巴豆總生物堿的生理活性顯著，有顯著的抗癌作用[2-4]，對甲狀腺癌、胃癌、肝癌等多種腫瘤都具有治療作用[5]。田艷偉[6]發(fā)現(xiàn)巴豆水提液具有顯著的誘導白血病細胞向正常方向分化的作用，甲醇提取物可以顯著抑制HIV-1病毒的傳染性[5]，說明巴豆生物堿多集中在親水性部位，但目前文獻尚未見報道巴豆生物堿的具體化學成分組成，因此有必要對總生物堿成分進行測定。雖然有文獻報道了巴豆總生物堿的含量測定方法[7]，但我們此次建立的新方法，對總生物堿提取完全，精密度、重現(xiàn)性等較好，方法更加簡便、快速。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

UV2802-pc紫外分光光度計(上海尤尼柯儀器有限公司)，Waters2695高效液相色譜儀，TB-215D型十萬分之一天平(賽多利斯科學儀器有限公司)，HH-4電熱恒溫水浴鍋(江蘇常州國華電器有限公司)，F(xiàn)W-100高速粉碎機(天津泰斯特儀器有限公司)，KQ2100DB超聲波清洗器(浙江昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2 試藥

巴豆苷對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號：11856-201001)；乙醚、硫酸、甲醇(北京化工廠)，均為分析純；色譜級甲醇、乙腈(FisherScientific)，水為雙蒸水。巴豆藥材經(jīng)北京市中醫(yī)學校金世元教授鑒定為大戟科植物巴豆Croton tiglium L.的干燥成熟果實。巴豆藥材來源及批號見表1。

表1 巴豆藥材來源批次表

2 方法與結(jié)果

2.1 對照品溶液的制備

取巴豆苷對照品適量，精密稱定，加水配制成76.8μg·mL-1的對照品溶液。

2.2 供試品溶液的制備

取巴豆種仁粉末(過三號篩)約0.3g，精密稱定，置索氏提取器中，加乙醚50mL，加熱回流3h，棄去乙醚液，藥渣揮干溶劑，連同濾紙筒移入具塞錐形瓶中，精密加入1％的硫酸溶液50mL，稱定重量，超聲處理(功率300 W，頻率24 kHz)30min，放冷，再稱定重量，用1％的硫酸溶液補足減失的重量，搖勻，濾過，取濾液1mL加1％的硫酸溶液定容至10mL，搖勻，備用[1]。

2.3 測定波長的選擇

分別取對照品溶液和供試品溶液，以相應試劑為空白，在200～400nm波長范圍內(nèi)進行掃描，見圖1和圖2。結(jié)果顯示兩者都在292nm附近有最大吸收，故選擇292nm為測定波長。

圖1 巴豆生物堿部位紫外掃描圖

圖2 巴豆苷對照品紫外掃描圖

2.4 線性關(guān)系的考察

精密量取巴豆苷對照品溶液0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0mL移入10mL容量瓶中，加水至刻度。以水為空白在292nm下測定吸光度，以濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制標準曲線，得回歸方程Y＝0.036 5X-0.029 7，r＝0.999 9(n＝6)。結(jié)果表明，樣品液在 3.84～23.04μg·mL-1呈線性關(guān)系。

2.5 精密度試驗

取供同一供試品溶液，于292nm下重復測定6次，其吸光度的RSD＝0.21％，表明儀器的精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗

取同一供試品溶液，按上述方法在1，2，3，4，5，6h時分別測定吸光度，其RSD＝0.29％，表明供試品溶液在6h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 重復性試驗

精密稱取同一樣品6份，按2.3制備成供試品溶液，在292nm下測定吸光度，計算含量，其RSD＝0.78％，表明重復性良好。

2.8 加樣回收率試驗

精密稱取已知含量的同一樣品粉末6份，每份0.15g，精密稱定，分別精密加入適量巴豆苷對照品，按2.3制備供試品溶液，按上述方法測定吸光度，計算加樣回收率，結(jié)果見表2。

表2 巴豆苷加樣回收率試驗

2.9 樣品含量測定

按照《中國藥典》2010版一部“巴豆”項下巴豆苷測定方法測定藥材中巴豆苷的含量[1]，按照2.3項下制備供試品溶液，并依照建立的方法測定3個不同來源的巴豆藥材的總生物堿含量，結(jié)果見表3。

表3 巴豆中巴豆苷與總生物堿含量測定結(jié)果(n＝2)/％

3 討論

在供試品溶液的制備過程中，考察了不同提取方法、提取溶劑、提取時間以及料液比對總生物堿含量的影響，發(fā)現(xiàn)用50mL的1％硫酸超聲提取30min，可以將0.3g樣品中總生物堿提取完全。

曾寶等[7]以自提的木蘭花堿為對照采用酸性染料法測定巴豆中總生物堿含量，本課題組認為木蘭花堿是毛茛科植物粗果唐松草的根莖中主要的活性物質(zhì)，在花椒、淫羊藿等植物中均有發(fā)現(xiàn)，不是巴豆的特異性成分，該法提取的總生物堿含量最高僅為0.42％，但巴豆苷作為巴豆生物堿的1種，《中國藥典》2010版規(guī)定其含量不低于0.80％[1]，雖然含量測定方法不同，但是單體含量不太可能高于有效部位的含量，推測是因為該方法采用40％的乙醇提取，部分水溶性較強的成分未提取完全所致。

本法以巴豆的指標性成分巴豆苷為對照，采用紫外分光光度法測定巴豆中總生物堿的含量，供試品前處理方法與《中國藥典》巴豆苷的提取方法相似，容易掌握，且能將生物堿提取完全，能夠簡單、快速、準確地測定巴豆總生物堿的含量，可以作為控制巴豆及巴豆霜質(zhì)量的方法。

[1]國家藥典委員會.中國藥典[S].一部.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：74.

[2]王明艷，瞿融，許冬青.巴豆生物堿誘導人胃腺癌SGC-7901細胞凋亡的研究[J].南京中醫(yī)藥大學學報，2010，26(9)：368-369.

[3]陳武，陳鵬英，劉鵬，等.巴豆生物堿對人肝癌SMMC-7721細胞凋亡及Bax，Bcl-2蛋白表達的影響[J].中國實驗方劑學雜志，2011，11(6)：17.

[4]趙小迎，陳俊，蔡平生.巴豆生物堿抑制卵巢癌細胞增殖和誘導其凋亡的實驗研究[J].中國全科醫(yī)學，2010，13(21)：13-20.

[5]劉秀德，隋在云.巴豆總生物堿對癌細胞質(zhì)膜流動性及胞漿基質(zhì)結(jié)構(gòu)的影響[J].山東中醫(yī)藥大學學報，1995，14(3)：192-194.

[6]田艷偉.巴豆水提取液對HL-60細胞的誘導分化作用[J].山西醫(yī)藥雜志，2002，31(3)：265.

[7]曾寶，李生梅，古俊輝，等.酸性染料法測定巴豆中總生物堿的含量[J].廣東藥學院學報，2012，28(2)：170-172.

Determ ination of Total A lkaloids in Crotonis Fructus by Ultraviolet Spectr-ophometry

JIN Feng1，ZHANG Zhen-ling1，REN Yu-ren2，CHEN Yan-lin2，DU jie2，ZHOU Lin2，BAIZong-li2，LIANG Huan2
(1.Henan College of Traditional Chinese Medicine，Zhengzhou 450008，China；2.China National Corp.of Traditional＆Herbal Medicine，Beijing 102600，China)

Objective：To establish a simple method for determination Alkaloids contents from Crotonis Fructus.M ethods：Adopting Crotonoside as reference，alkaloids in Crotonis Fructus were detected by ultraviolet spectrophotometry at292nm.Results：The liner arrange of crotonoside was 3.84～23.84μg·mL-1(Y＝0.036 5X-0.029 7，r＝0.999 9).The mean recovery of crotonoside was 101.38％(RSD＝1.21％).Conclusion：The method is accurate，simple，quick，sensitive and reproducible.

Crotonis Fructus；Total Alkaloids；Content determination；Ultraviolet spectr-ophometry

2012-07-10)

2011年中醫(yī)藥行業(yè)科研專項——附子等中藥炮制方法傳承與規(guī)范化應用研究(201107008)

*[通訊作者]張振凌，Tel：(0371)65680970，E-mail：zhangzl7658＠163.com；任玉珍，E-mail：renjl2008＠163.com