任 珂，楊仁斌，傅 強(qiáng)

（湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)環(huán)保研究所，湖南 長(zhǎng)沙410128）

蟲螨腈（Chlorfenapyr）又名除盡、溴蟲腈，是一種新型取代芳基吡咯類殺蟲、殺螨劑[1]。主要通過(guò)作用于昆蟲體內(nèi)多功能氧化酶（MFO）來(lái)抑制線粒體ADP向ATP轉(zhuǎn)化，由于其作用機(jī)理新穎，殺蟲譜廣、對(duì)常規(guī)農(nóng)藥無(wú)交互抗性，近年來(lái)廣泛應(yīng)用于防止水稻、棉花、蔬菜、柑桔、葡萄、大豆等作物的多種害蟲和害螨[2]。然而，研究表明蟲螨腈對(duì)人、鳥、魚、蠶低毒，同時(shí)對(duì)小鼠的肝、脾、腎細(xì)胞DNA會(huì)產(chǎn)生損傷[3]。因此，許多國(guó)家對(duì)蟲螨腈的殘留限量都進(jìn)行了嚴(yán)格的規(guī)定，如美國(guó)國(guó)家環(huán)保署規(guī)定溴蟲腈在各種蔬菜、水果上的最大允許殘留量為1 mg/kg，日本規(guī)定在大豆、青花菜、小松菜、四季豆、大蔥、胡蘿卜等蔬菜產(chǎn)品上的MRL分別為0.05、3.0、3.0、0.05、3.0、0.1 mg/kg[4]。目前國(guó)內(nèi)有關(guān)蟲螨腈在土壤、蔬菜、煙葉等農(nóng)產(chǎn)品中的殘留分析方法已有不少研究，主要采用氣相色譜法（GC）和氣相色譜-負(fù)化學(xué)電離質(zhì)譜法（GC-NCIMS）等[5-10]。氣相色譜法需要萃取和過(guò)柱2次凈化，操作步驟繁瑣；氣相色譜-負(fù)化學(xué)電離質(zhì)譜法雖然準(zhǔn)確度和靈敏度高，但儀器價(jià)格昂貴。試驗(yàn)采用高效液相色譜法對(duì)稻田環(huán)境及水稻中蟲螨腈的殘留進(jìn)行分析，旨在為高效液相色譜法在蟲螨腈殘留檢測(cè)中的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

島津-LC-20AT型高效液相色譜儀（日本島津公司，帶紫外檢測(cè)器和工作站），KYC-1102C型恒溫雙層培養(yǎng)搖床（上海?，攲?shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司），RE-2000型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠），DLSB-5L/25型低溫水循環(huán)泵（鞏義市予華儀器廠），SHZ-D（Ⅲ）循環(huán)水式真空泵（鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司），F(xiàn)W80高速萬(wàn)能粉碎機(jī)（北京市永光明醫(yī)療儀器廠），KQ-100E超聲波清洗器（昆山市超聲波儀器有限公司）等。

蟲螨腈標(biāo)準(zhǔn)品（純度98.61%，農(nóng)藥檢定所）、甲醇（色譜純），丙酮、二氯甲烷、乙腈、氯化鈉、無(wú)水硫酸鈉、中性氧化鋁（均為分析純）、活性炭等。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.1 樣品制備 稻田水樣采用定性快速濾紙過(guò)濾；稻田土樣送回實(shí)驗(yàn)室后去掉植物殘?bào)w、砂石，將樣品混勻，采用四分法縮分樣品，取出其中的1/4裝入樣品袋中，貯存在－20℃的冰箱中；水稻稻株剪碎成1 cm以下小段，混勻；再粉碎稻米和稻殼，分別將處理的稻株、稻米和稻殼樣品裝入樣品袋，放入－20℃冰箱中貯存，備用。

1.2.2 樣品提取 水樣：準(zhǔn)確量取100 mL待測(cè)水樣于250 mL分液漏斗中，依次用50、40、30 mL二氯甲烷萃取，合并二氯甲烷相經(jīng)無(wú)水硫酸鈉干燥后，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上（45℃）濃縮至近干。

土樣：準(zhǔn)確稱取待測(cè)土樣20 g于250mL的具塞三角瓶中，用40 mL乙腈超聲提取15 min，轉(zhuǎn)入已加有5～8 g Nacl固體的100 mL具塞量筒中，劇烈振搖1 min后靜置分層，用移液管移出上層有機(jī)相20 mL于250 mL具塞三角瓶中，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上（45℃）濃縮至近干。

水稻稻株、稻米、稻殼：稱取稻株、稻米、稻殼樣品10 g，于250 mL的具塞三角瓶中，稻株樣品用80 mL丙酮超聲提取15 min（稻米和稻殼用80 mL甲醇提?。?，經(jīng)過(guò)布氏漏斗減壓抽濾，用20 mL丙酮（甲醇）分3次洗滌殘?jiān)统闉V瓶，合并抽濾液入250 mL具塞三角瓶中，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上（45℃）濃縮至近干。

1.2.3 樣品凈化 稻田水樣、土樣、稻米樣品：樣品較干凈（無(wú)需凈化），直接用5 mL色譜甲醇定容，待測(cè)。

稻株和稻殼樣品：在2 g中性氧化鋁+0.5 g活性炭的層析柱中，先用20 mL二氯甲烷和甲醇（體積比7∶3）混合溶液預(yù)淋，再用60 mL二氯甲烷和甲醇（體積比7∶3）混合溶液轉(zhuǎn)移濃縮提取液，收集。于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上（45℃）濃縮近干，再用5.0 mL色譜甲醇定容，待測(cè)。

1.2.4 高效液相色譜檢測(cè)條件 色譜柱為Inertsil ODS-SP色譜柱，5μm，250 mm×4.6 mm（i.d.）；流動(dòng)相為甲醇-水（體積比83∶17）；流速1.0 mL/min；柱溫30℃；紫外檢測(cè)波長(zhǎng)260 nm；進(jìn)樣量20μL；在上述色譜條件下，蟲螨腈的相對(duì)保留時(shí)間為8.280 min；外標(biāo)法定量。

1.2.5 加標(biāo)回收試驗(yàn) 依據(jù)國(guó)外制定的蟲螨腈在水稻上的最大殘留限量，設(shè)置了0.1、1.0、5.0 mg/kg 3個(gè)添加水平，進(jìn)行空白樣品加標(biāo)回收試驗(yàn)。分別量取100 mL水、稱取20 g土壤、10 g稻株、稻米、稻殼空白樣品，設(shè)置5組平行處理，加入一定量的蟲螨腈標(biāo)準(zhǔn)溶液，使空白樣品中蟲螨腈的質(zhì)量濃度為0.1、1.0、5.0 mg/kg，按上述方法進(jìn)行提取、凈化和液相色譜檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品前處理?xiàng)l件優(yōu)化

2.1.1 樣品提取溶劑的選擇 添加1 mg/L的蟲螨腈標(biāo)樣到稻株、稻米和稻殼中，分別加入乙腈、甲醇、丙酮80mL超聲15min進(jìn)行比較。結(jié)果表明：在水稻稻株中用乙腈和甲醇為提取劑其回收率為40.07%～53.69%；若在稻米中，選用乙腈和丙酮提取，空白有較大峰，回收率偏低且有雜質(zhì)峰干擾；在稻殼中選用丙酮其回收率為44.29%，均不符合要求，用乙腈做提取劑樣品中有雜質(zhì)干擾，回收率偏高（見(jiàn)表1）。因此選擇丙酮提取稻株中的蟲螨腈，甲醇提取稻殼和稻米中的蟲螨腈。

表1 不同提取劑對(duì)水稻稻株、稻米、稻殼中蟲螨腈回收率的影響

2.1.2 樣品提取方法的確定 振蕩1 h和超聲15 min提取方法的比較結(jié)果表明，無(wú)論低濃度還是高濃度加標(biāo)試樣，2種提取方法回收率都能達(dá)80%以上。相比振蕩提取，該方法縮短了提取時(shí)間，節(jié)約了能源。

2.2 樣品凈化方法的篩選

2.2.1 層析柱的確定 稻株和稻殼樣品用丙酮和甲醇超聲提取后，色素深，雜質(zhì)多，不能直接測(cè)定，故需要進(jìn)一步凈化，分別選取中性氧化鋁-活性炭和弗羅里硅土作為吸附劑。從凈化結(jié)果來(lái)看，兩者去色素效果均較好，都可應(yīng)用于樣品凈化。但弗羅里硅土柱農(nóng)藥峰受雜質(zhì)干擾。因此，試驗(yàn)選擇中性氧化鋁-活性炭為吸附劑。

2.2.2 淋洗劑的確定 由于蟲螨腈易溶于丙酮、乙腈和醇類，根據(jù)化學(xué)溶劑的極性強(qiáng)弱，配置石油醚∶乙酸乙酯、二氯甲烷∶乙酸乙酯、甲醇∶乙酸乙酯三種淋洗劑。但通過(guò)蟲螨腈與稻株和稻殼中的分離情況，最終確定選用甲醇∶乙酸乙酯。再進(jìn)行柱淋洗試驗(yàn)，通過(guò)測(cè)定加標(biāo)回收率（見(jiàn)表2），確定最佳的淋洗劑組成為甲醇∶二氯甲烷=30∶70。

表2 柱層析凈化中不同淋洗劑對(duì)稻株和稻殼中蟲螨腈回收率的影響

2.2.3 淋洗液用量確定 淋洗曲線（圖1）表明，采用0.10 mg/L添加水平時(shí)所需的體積為60 mL。

圖1 蟲螨腈淋洗曲線

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線與色譜圖

圖2 蟲螨腈標(biāo)準(zhǔn)色譜圖

蟲螨腈標(biāo)準(zhǔn)色譜峰見(jiàn)圖2，其相對(duì)保留時(shí)間為8.280 min。在1.2.4儀器檢測(cè)條件下，蟲螨腈峰面積與進(jìn)樣質(zhì)量在1～40 ng范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，線性回歸方程為：y=37 284 x+303.79，相關(guān)系數(shù)為：R2=0.9999。

2.4 方法靈敏度

在上述色譜條件下，蟲螨腈的最低檢出質(zhì)量為1.0×10-9g（S/N=3），通過(guò)最低濃度添加試驗(yàn)得到樣品在稻田水、土、稻株、稻米、稻殼中的最低檢出濃度分別為0.005、0.05、0.1、0.1、0.5、0.01mg/kg。

2.5 方法的回收率和精密度

在空白樣品中的加標(biāo)回收試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。由表3可知：方法的準(zhǔn)確度和精密度均符合國(guó)家農(nóng)藥行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)—《農(nóng)藥殘留實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)則（NY/T788-2004）》的要求，能夠用于實(shí)際樣品的殘留檢測(cè)分析。

表3 蟲螨腈在水稻及稻田環(huán)境中的方法回收率

2.5.1 稻田水中蟲螨腈加標(biāo)回收 用50、40、30 mL二氯甲烷萃取3次，能去除雜質(zhì)。蟲螨腈在稻田水樣中的平均加標(biāo)回收率為93.56%～96.77%，標(biāo)準(zhǔn)差為1.43～2.76，變異系數(shù)為1.48%～2.95%?？瞻姿畼雍图訕?biāo)1mg/kg蟲螨腈樣品色譜峰見(jiàn)圖3、圖4。

2.5.2 稻田土壤中蟲螨腈加標(biāo)回收 適量的乙腈能很好的從土壤中提取出蟲螨腈，經(jīng)過(guò)固液萃取，可省去繁瑣的過(guò)柱操作。蟲螨腈在稻田土樣中的平均加標(biāo)回收率為93.22%～99.96%，標(biāo)準(zhǔn)差為1.42～2.79，變異系數(shù)為1.52%～2.79%。空白土樣和加標(biāo)1 mg/kg蟲螨腈樣品色譜峰見(jiàn)圖5、圖6。

圖3 水樣空白色譜圖

圖4 水樣添加蟲螨腈色譜圖

圖5 土樣空白色譜圖

圖6 土樣添加蟲螨腈色譜圖

2.5.3 稻田稻株中蟲螨腈加標(biāo)回收 適量的丙酮能有效的提取水稻稻株中的蟲螨腈，且經(jīng)中性氧化鋁-活性炭過(guò)柱后，不影響蟲螨腈的檢測(cè)。蟲螨腈在水稻稻株中的平均加標(biāo)回收率為103.21%～109.22%，標(biāo)準(zhǔn)差為1.88～3.35，變異系數(shù)為1.82%～4.41%?？瞻淄翗雍图訕?biāo)1mg/kg蟲螨腈樣品色譜峰見(jiàn)圖7、圖8。

圖7 稻株空白色譜圖

圖8 水稻稻株添加蟲螨腈色譜圖

2.5.4 稻米中蟲螨腈加標(biāo)回收 樣品經(jīng)甲醇提取后能很好的去除雜質(zhì)，不需要繁瑣的過(guò)柱操作。蟲螨腈在稻米中的平均加標(biāo)回收率為91.41%～98.46%，標(biāo)準(zhǔn)差為0.65～3.75，變異系數(shù)為0.68%～3.81%?？瞻淄翗雍图訕?biāo)1mg/kg蟲螨腈樣品色譜峰見(jiàn)圖9、圖10。

2.5.5 稻殼中蟲螨腈加標(biāo)回收 樣品經(jīng)甲醇提取后，需經(jīng)中性氧化鋁-活性炭層析住過(guò)柱去除雜質(zhì)。蟲螨腈在稻殼中的平均加標(biāo)回收率為103.84%～112.33%，標(biāo)準(zhǔn)差為1.43～4.16，變異系數(shù)為1.38%～4.01%?？瞻淄翗雍图訕?biāo)1 mg/kg蟲螨腈樣品色譜峰見(jiàn)圖11、圖12。

圖9 稻米空白色譜圖

圖10 稻米添加蟲螨腈色譜圖

圖11 稻殼空白色譜圖

圖12 稻殼添加蟲螨腈色譜圖

3 小結(jié)

研究結(jié)果表明，稻株和稻殼中蟲螨腈殘留物分別由丙酮和甲醇超聲提取后，再經(jīng)中性氧化鋁-活性炭柱層析凈化，用HPLC-UVD檢測(cè)是可行的。

試驗(yàn)的稻米樣品雖未采用凈化方法，樣品雜質(zhì)峰較多，但均能與樣品峰分開，不影響檢測(cè)，從而簡(jiǎn)化了操作程序。

當(dāng)蟲螨腈在稻田水、土、稻株、稻米、稻殼中的濃度范圍為0.1～5.0 mg/kg時(shí)，相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)添加回收率范圍為91.42%～112.33%，標(biāo)準(zhǔn)差為0.65～4.59，變異系數(shù)為0.68%～4.41%，均達(dá)到農(nóng)藥殘留分析的要求。該方法可用于稻田環(huán)境中蟲螨腈的殘留分析。

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