楊進(jìn)平，吳 林，陳 煒，鄭?？?，蔡鑫昆，溫惠娟，王青碧，畢信亞

阿爾茨海默?。ˋD）又稱(chēng)老年性癡呆，是一種以進(jìn)行性記憶障礙和智能衰退為主要臨床特征的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾?。?］。AD發(fā)病機(jī)制極其復(fù)雜，病因?qū)W尚不清楚，其典型的病理特征是老年斑（SP）形成、神經(jīng)纖維纏結(jié)（NFT）及膽堿能神經(jīng)元的變性、壞死。其中，NFT的數(shù)量和患者的癡呆程度呈明顯的正相關(guān)，被認(rèn)為是AD患者的神經(jīng)元退化的病理基礎(chǔ)［2］，是AD的核心病理改變。NFT的主要成分是由異常過(guò)度磷酸化的tau蛋白聚集而形成的雙螺旋（PHFs）。糖元合成酶激酶3β（GSK－3β）是最重要的催化tau蛋白磷酸化的蛋白激酶之一［3］，GSK－3β在tau蛋白磷酸化及其在AD致病過(guò)程的作用及GSK－3β抑制劑在AD防治方面具有潛在作用［4］。而蛋白質(zhì)磷酸酶2A（PP2A）是一種絲／蘇氨酸磷酸酶，能使蛋白質(zhì)脫磷酸，PP2A活性的降低可能是導(dǎo)致AD患者腦中Tau蛋白過(guò)度磷酸化的原因［5］。

本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用腦立體定向技術(shù)向大鼠海馬注射岡田酸建立AD大鼠動(dòng)物模型，采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)大鼠海馬GSK－3β和PP2A活性，觀察溫脾通絡(luò)開(kāi)竅湯對(duì)其表達(dá)水平的影響，探討溫脾通絡(luò)開(kāi)竅湯抗AD的作用及機(jī)制。

1 材料與方法

1．1 材料

1．1．1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 3月齡SPF級(jí)雄性SD大鼠60只，體重（200±20）g，由廣西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心提供（編號(hào)：SCXK2007－0002）。

1．1．2 實(shí)驗(yàn)藥品及試劑 溫脾通絡(luò)開(kāi)竅方（黃芪30g，益智仁10g，三七10g，石菖蒲10g，何首烏10g，絞股藍(lán)10g），由江蘇江陰天江藥業(yè)有限公司提供中藥配方顆粒；岡田酸（OA）Sigma公司生產(chǎn)（批號(hào)：04511）；二甲亞砜（DMSO）Amresco公司生產(chǎn)（批號(hào)：0231）；石杉?jí)A甲，浙江震元制藥有限公司生產(chǎn)（批號(hào)：120303）；GSK－3β及PP2A大鼠Elisa試劑盒均購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1．1．3 主要器材和設(shè)備 腦立體定位儀（ST－3ND型腦立體定位），成都儀器廠生產(chǎn)；Morris水迷宮設(shè)備全套（包括Morris水迷宮、電腦攝像系統(tǒng)、配套軟件分析系統(tǒng)），北京中科院生理所生產(chǎn)；酶標(biāo)儀（ELX－800，美國(guó)BlO－Tek）。

1．2 實(shí)驗(yàn)方法

1．2．1 造模方法 60只SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，大鼠經(jīng)10%水合氯醛3mL／kg腹腔注射麻醉后，固定于大鼠腦立體定位儀上。52只大鼠實(shí)施OA右側(cè)的海馬CA1區(qū)注射造模，另8只作為空白對(duì)照組。參照George等《大鼠腦立體定向圖譜》，選擇右側(cè)海馬CA1區(qū)，為注射靶區(qū)。用特制三棱針手動(dòng)鉆顱骨，將溶于10%DMSO的 OA 1．5μL（0．4mmol／L）緩慢注入?？瞻捉M大鼠于相同部位注射等體積的10%DMSO。間隔2d后以相同方法再注射一次。所有大鼠術(shù)后傷口均涂適量紅霉素軟膏，術(shù)后腹腔注射青霉素鈉8×104U／只，以防感染。

1．2．2 Morris水迷宮制作及MWM定位航行實(shí)驗(yàn) MWM參照相關(guān)文獻(xiàn)制作［6］，將水池等分為4個(gè)象限，在第三象限中心放置一黑色平臺(tái)，平臺(tái)為圓形，直徑11cm，平臺(tái)高28cm（稱(chēng)隱藏平臺(tái)）。水迷宮正上方2m高處裝有一個(gè)小型攝像機(jī)，記錄大鼠逃避潛伏期及跨越平臺(tái)次數(shù)。MWM實(shí)驗(yàn)共進(jìn)行4．5d。定位航行實(shí)驗(yàn)：每天分上下午2個(gè)時(shí)間段，每個(gè)時(shí)間段每只大鼠訓(xùn)練4次。每次均隨機(jī)順序從不同等分水池的4個(gè)起點(diǎn)將大鼠面向池壁放入池中，記錄其60s內(nèi)成功進(jìn)駐平臺(tái)所需時(shí)間（即逃避潛伏期）。如在60s內(nèi)大鼠不能成功進(jìn)駐平臺(tái)，則將其引上平臺(tái)并令其停留10s，記錄逃避潛伏期為60s，每次訓(xùn)練間隔時(shí)間為60s。每一時(shí)間段內(nèi)4次潛伏期的算術(shù)均數(shù)作為這一時(shí)間段的成績(jī)。

1．2．3 AD模型篩選 造模14d后進(jìn)行AD模型篩選，按照上述定位航行實(shí)驗(yàn)方法，參照趙憲林等［7］的AD大鼠模型篩選標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行篩選，計(jì)算模型組大鼠各時(shí)段成績(jī)平均逃避潛伏期與參考值之差占該鼠的平均逃避潛伏期時(shí)間比例，該值＞20%定為AD大鼠。造模2周內(nèi)造模組大鼠死亡4只，空白組死亡1只。經(jīng)過(guò)篩選，造模組48只大鼠符合要求的大鼠40只進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，造模成功率為76．9%。

1．3 分組及給藥劑量 將造模成功的模型組大鼠40只隨機(jī)分為溫脾通絡(luò)開(kāi)竅方高、中、低劑量組，西藥對(duì)照組，模型組。每組8只?？瞻捉M7只。造模第20天開(kāi)始灌胃給藥，給藥量均按人與大鼠體表面積系數(shù)比確定，以臨床人用藥等效劑量作為中劑量，中藥高、中、低劑量組大鼠的給藥劑量分別為4．15g／kg、8．3 g／kg、16．9g／kg，西藥組給藥劑量為3mg／kg。模型組及空白對(duì)照組均予相應(yīng)體積的雙蒸水灌胃。各組大鼠按劑量每天灌胃給藥一次，共21d。治療期間，模型組、中藥低劑量組、中藥中劑量組各死亡2只，西藥組、中藥高劑量各死亡1只。

1．4 取材 動(dòng)物水迷宮后斷頭，冰臺(tái)上迅速取腦，分離海馬組織一部分放入－80℃冰箱凍存為下一步實(shí)驗(yàn)備用。另一部分稱(chēng)其重量，加入一定量的PBS（pH7．4）溶液，用勻漿器將標(biāo)本勻漿 充分，離心20min左右（3 000r／min），收集上清，分裝后放于－80℃待檢測(cè)。

1．5 檢測(cè)方法 標(biāo)準(zhǔn)品稀釋與加樣：在酶標(biāo)包被板上設(shè)標(biāo)準(zhǔn)孔8個(gè)。每孔中各加入標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液50μL。加樣：設(shè)空白孔、待測(cè)樣品孔。在酶標(biāo)包被板上待測(cè)樣品孔中先加樣品稀釋液40 μL，然后再加待測(cè)樣品10μL。溫育：用封板膜封板后置37℃溫育30min。配液：將20倍濃縮洗滌液用蒸餾水20倍稀釋后備用。洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30s后棄去，如此重復(fù)5次，拍干。加酶：每孔加入酶標(biāo)試劑50μL，空白孔除外。顯色：每孔先加入顯色劑A 50μL，再加入顯色劑B 50μL，輕輕震蕩混勻，37℃避光反應(yīng)15min。使用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)依序測(cè)量各孔的吸光度（OD值）。

1．6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS15．0分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，若方差齊，采用單因素方差分析，若方差不齊則對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行適當(dāng)?shù)淖兞哭D(zhuǎn)換以滿足方差齊性檢驗(yàn)，若轉(zhuǎn)換數(shù)據(jù)仍未達(dá)到方差齊要求，則改用秩和檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

Elisa結(jié)果，模型組GSK－3β的活性較空白組有提高（P＜0．05），而PP2A的表達(dá)兩者相比有降低。中藥低劑量組和西藥組與模型組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。中藥高、中劑量組與模型組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05），GSK－3β的活性亦明顯低于模型組，而PP2A的表達(dá)明顯高于模型組，其中尤以中藥高劑量組的作用最明顯，中藥高、中、低劑量組之間存在一定的量效關(guān)系。詳見(jiàn)表1。

表1 溫脾通絡(luò)開(kāi)竅法對(duì)AD大鼠腦組織GSK－3β和PP2A活性的影響（±s） pg／mg

表1 溫脾通絡(luò)開(kāi)竅法對(duì)AD大鼠腦組織GSK－3β和PP2A活性的影響（±s） pg／mg

與空白組比較，1）P＜0．05；與模型組比較，2）P＜0．05；與西藥組比較，3）P＜0．05

組別 劑量 n GSK－3βPP2A空白組 生理鹽水7 2．69±0．48 9．21±1．87模型組 生理鹽水 6 8．05±1．471） 2．89±0．361）西藥組 3mg／（kg·d） 7 7．87±1．33 3．41±0．63高劑量組16．9mg／（kg·d） 7 6．19±0．772）3） 4．11±0．812）3）中劑量組 8．3mg／（kg·d） 6 7．45±1．052） 3．72±0．742）低劑量組4．15mg／（kg·d） 6 7．98±1．41 3．23±0．48

3 討 論

GSK－3β是一個(gè)深受關(guān)注的蛋白激酶［8］，因能夠磷酸化并抑制糖原合成過(guò)程中的限帶酶－糖原合成酶（glycogen synthase）而得名。GSK－3β是AD腦中引起Tau蛋白異常過(guò)度磷酸化的最主要蛋白激酶，其在AD腦中含量增高，并主要集中于神經(jīng)元纖維纏結(jié)。它主要參與AD的病理形成，主要途徑是使微管相關(guān)蛋白（Tau蛋白）磷酸化，在許多異常磷酸化位點(diǎn)使Tau蛋白磷酸化，Tau磷酸化后導(dǎo)致微管蛋白不穩(wěn)定，并聚集成神經(jīng)纖維纏結(jié)，可致神經(jīng)元可塑性改變及神經(jīng)元退行性變化［9］，GSK－3β在許多異常磷酸化位點(diǎn)使Tau蛋白磷酸化，目前的研究證實(shí)，GSK－3β能夠磷酸化Tau蛋白上的10個(gè)位點(diǎn)，這一活性能調(diào)節(jié)Tau與微管的結(jié)合，進(jìn)而影響神經(jīng)元的結(jié)構(gòu)和可塑性。GSK－3β的活性可通過(guò)磷酸化調(diào)節(jié)，Ser9磷酸化后活性抑制，而Ty r216磷酸化后活性增高［10］。另外，GSK－3β抑制對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)錐的延伸和運(yùn)動(dòng)性亦是十分重要的。GSK－3β對(duì)微管結(jié)合域C端的磷酸化能力較強(qiáng)，且被GSK－3β磷酸化的tau蛋白有更強(qiáng)的成纖維特性［11］。

蛋白質(zhì)磷酸酶2A是一種絲／蘇氨酸磷酸酶，能夠使蛋白質(zhì)脫磷酸，具有多種生物活性。蛋白磷酸酯酶的降低，特別是PP2A活性的降低可能是導(dǎo)致AD腦中tau以及其他蛋白過(guò)度磷酸化的原因［6］。具有代謝活性的大鼠腦片和轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型研究表明，PP2A的活性降低不僅僅導(dǎo)致其催化tau去磷酸化的能力下降，而且還可通過(guò)激活cAMP依賴性蛋白激酶（PKA）、應(yīng)激激活的蛋白激酶和鈣／鈣調(diào)蛋白依賴性的蛋白激酶Ⅱ（CaMK2Ⅱ）和應(yīng)激激活蛋白激酶等激酶的活性來(lái)引起tau的異常過(guò)度磷酸化。實(shí)驗(yàn)研究還發(fā)現(xiàn)，AD患者腦中磷酸酶PPI，PP2A和PP2B的活性均明顯低于正常腦，特別是PP2A的活性丟失嚴(yán)重，而蛋白激酶的活性則顯著升高。張魁華等［12］發(fā)現(xiàn)，AD模型組大鼠腦組織神經(jīng)元表達(dá)脫磷酸的磷酸酯酶PP2A明顯減少，降低程度為正常的66%左右，而溫脾通絡(luò)開(kāi)竅方治療組可以使這種現(xiàn)象得到改善。

本實(shí)驗(yàn)采用岡田酸海馬區(qū)注射制作AD模型，通過(guò)ELISA方法檢測(cè)大鼠海馬GSK－3β和PP2A的活性，模型組大鼠海馬GSK－3β的水平較空白組有明顯降低，中藥組各組GSK－3β的水平較模型組有所下降，其中高、中劑量組作用明顯。模型組大鼠海馬PP2A的水平較空白組有明顯升高，中藥組各組PP2A的水平較模型組有所升高，其中高、中劑量組作用明顯。從以上可以看出，本實(shí)驗(yàn)中藥組之間存在一定的量效關(guān)系，溫脾通絡(luò)開(kāi)竅方在一定劑量范圍內(nèi)可以抑制GSK－3β和提高PP2A的活性，降低AD模型大鼠Tau異常磷酸化的水平，故溫脾通絡(luò)開(kāi)竅方具有抗AD的治療作用。

由于AD發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，單一作用點(diǎn)藥物很難取得滿意效果，目前仍缺乏有效的防治藥物，臨床主要用膽堿酯酶抑制劑，但也只能改善早、中期患者的部分癥狀。而中醫(yī)藥不但在緩解衰老及衰老相關(guān)疾病的防治方面有著豐富的理論和實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)，且其還具有多途徑、多方式、多靶點(diǎn)特征。本研究結(jié)果也體現(xiàn)了溫脾通絡(luò)開(kāi)竅湯多靶點(diǎn)、多途徑的優(yōu)勢(shì)。

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