何玉萍，江 湧，何玉珊，許翌嘉

動脈硬化（AS）是動脈血管壁的一種慢性炎癥性疾?。?］，細胞黏附分子（CAMs）是介導細胞與細胞之間、細胞與細胞基質(zhì)之間相互黏附的糖蛋白，正常情況下呈低水平表達，在炎性反應刺激下表達明顯上調(diào)。研究表明，AS處內(nèi)皮細胞分泌的黏附分子增加，炎性基因的表達也增加［2］。本實驗采用單核細胞－內(nèi)皮細胞（MC－EC）聯(lián)合培養(yǎng)的方法，觀察氧化低密度脂蛋白（ox－LDL）對人臍靜脈內(nèi)皮細胞（ECV304）CAMs表達的影響，探討ox－LDL損傷血管內(nèi)皮細胞（VEC）的作用及機制。

1 材料與方法

1．1 材料 ECV304細胞株（中山大學細胞庫），人類單核細胞系U937（上海細胞生物研究所）；RPMI－1640培養(yǎng)液（美國GIBCO）；胎牛血清（美國 GIBCO）；低密度脂蛋白（LDL，美國SIGMA）；單克隆抗體CD106－FITC、CD54－PE、CD62E－PE、CD62P－PE、IgG－PE、IgG－FITC（均是美國PharMingen產(chǎn)品）；流式細胞儀：（美國BECKMAN COULTE公司 ALTRA型），四色熒光，配套EXPO 32采集分析軟件。

1．2 ox－LDL的制備 將LDL置于含10μmol／L CuSO4的PBS（pH7．2）溶液中，37℃溫育24h，再將ox－LDL液置含200 μmol／L EDTA的PBS 4℃中透析24h，超濾除菌后4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1．3 實驗方法

1．3．1 MTT法檢測不同濃度ox－LDL對細胞活性的影響細胞以5×104個／mL細胞數(shù)接種入96孔培養(yǎng)板，待細胞生長至穩(wěn)定狀態(tài)（約24h），分別加入ox－LDL高濃度組（100μg／mL）、中濃度組（50μg／mL）、低濃度組（25μg／mL），正常對照組加等量生理鹽水，置于37℃、5%CO2、95%空氣的培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h后，每孔加入10g／L的 MTT 10μL，培養(yǎng)4h，棄去培養(yǎng)基，每孔加入150μL二甲基亞砜（DMSO），置微量振蕩器上振蕩10 min，酶標儀（波長570nm）測定吸光值（OD），篩選ox－LDL適宜作用濃度。

1．3．2 ox－LDL對血管內(nèi)皮細胞黏附分子表達的影響 將ECV304細胞接種于24孔板，待細胞生長至穩(wěn)定狀態(tài)（約24 h），加入50μg／mL ox－LDL，對照組加等量生理鹽水，置于37℃、5%CO2、95%空氣的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24h后，移去培養(yǎng)液，每孔加入含4×104人類單核細胞系U937細胞培養(yǎng)基細胞懸液，37℃孵育30min，移去培養(yǎng)液，用PBS輕洗2遍，去除未黏附的細胞，用0．25%胰蛋白酶和0．02%EDTA混合液消化收集細胞，測定細胞間黏附分子－1（ICAM－1，CD54）、血管細胞黏附分子－1（VCAM－1，CD106）、E－選擇素（CD62E）和P－選擇素（CD62P）。

1．4 FCM檢測 VCAM－1、ICAM－1、CD62E、CD62P的表達率 收集上述單細胞懸液，PBS洗兩次，分別加入CD106－FITC、CD54－PE、CD62E－PE、CD62P－PE單克隆抗體各10 μL，室溫避光孵育30min后，PBS洗2遍，流式細胞儀檢測，其結(jié)果以陽性百分率表示。每份樣本均設(shè)陰性對照（加相應IgG抗體），以消除本底熒光的影響。

1．5 統(tǒng)計學處理 用SPSS16．0軟件進行t檢驗，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（±s）表示。

2 結(jié) 果

2．1 MTT檢測結(jié)果 ox－LDL作用的各組細胞活性均下降，與正常組比較，高、中濃度組有統(tǒng)計意義（P＜0．05），而低濃度組無統(tǒng)計意義，提示50μg／mL ox－LDL為適宜的作用濃度。詳見表1。

表1 ox－LDL不同濃度作用對內(nèi)皮細胞ECV304活性的影響（±s）

表1 ox－LDL不同濃度作用對內(nèi)皮細胞ECV304活性的影響（±s）

與正常組比較，1）P＜0．05

組別 n MTT（OD值）正常組10 0．771±0．062低濃度組 10 0．699±0．067中濃度組 10 0．624±0．0301）高濃度組 10 0．589±0．0551）

2．2 ox－LDL對血管內(nèi)皮細胞黏附分子表達的影響 ox－LDL作用損傷組細胞表面黏附分子VCAM－1、ICAM－1、CD62E、CD 62P表達率均明顯增高，與正常組比較有統(tǒng)計學意義（P＜0．01）。詳見表2。

表2 ox－LDL對ECV304細胞黏附分子表達的影響（±s） %

表2 ox－LDL對ECV304細胞黏附分子表達的影響（±s） %

與正常組比較，1）P＜0．05

組別 n VCAM－1 ICAM－1 CD62E CD62P正常組 10 3．66±1．19 50．82±6．62 12．27±1．43 5．54±0．76 ox－LDL損傷組 30 9．77±2．461） 77．62±3．181） 23．59±2．841） 18．96±2．171）

3 討 論

AS是危害人類健康最大的疾病之一，是心腦血管病的主要病理基礎(chǔ)，其發(fā)病機制復雜，尚未完全闡明。自Ross提出AS發(fā)病機制的“損傷反應”學說至今，VCE損傷在AS的形成與發(fā)展中的地位日趨受到關(guān)注。在AS解剖學證據(jù)出現(xiàn)之前已有內(nèi)皮功能紊亂的表現(xiàn)［3，4］，而VEC功能紊亂是AS發(fā)病的早期關(guān)鍵性環(huán)節(jié)［5］。

ox－LDL是AS明確的危險因子，動脈壁中ox－LDL的存在是造成動脈壁持續(xù)損傷重要因素之一，ox－LDL可直接損傷內(nèi)皮細胞，通過信號傳導通路改變內(nèi)皮細胞分泌活性，介導單核細胞對內(nèi)皮細胞的黏附，導致內(nèi)皮細胞的損傷［6，7］。人AS的斑塊中有ICAM－1的表達，并在AS的病理過程中起重要作用［8］。高血脂患者血中的可溶性的ICAM－1、VCAM－1均升高，認為血中可溶性ICAM－1、VCAM－1是反應動脈粥樣硬化的早期變化指標［9］。MC－EC黏附是內(nèi)皮細胞功能受損而處于激活狀態(tài)的表現(xiàn)之一，兩種細胞黏附不僅是物理接觸，而且涉及MC、EC細胞表面諸多分子之間的相互作用，在相互作用過程中兩種細胞的功能均發(fā)生相應變化，促進細胞CAMs表達，而CAMs介導的炎癥細胞與血管內(nèi)皮細胞的黏附及損傷作用，被認為是AS重要的始動環(huán)節(jié)，可作為炎癥活動的指標［2，10］。本實驗采用對 U937－ ECV304聯(lián)合培養(yǎng)的方法，用ox－LDL為誘導損傷因素，F(xiàn)CM進行分析ECV304細胞表面VCAM－1、ICAM－1、E－選擇素、P－選擇素的表達，探討ox－LDL致VEC損傷機制；結(jié)果顯示，ox－LDL促使內(nèi)皮細胞CAMs表達明顯上調(diào)，提示ox－LDL在內(nèi)皮細胞黏附分子合成或誘導過程中扮演了較為重要的角色，ox－LDL刺激誘導內(nèi)皮細胞CAMs表達增高，而CAMs的高表達，又促進單核細胞黏附于內(nèi)皮細胞，影響血管內(nèi)皮細胞功能，參與AS化的形成和發(fā)展。

VEC是多種危險因子作用的重要靶器官。Ox－LDL通過介導單核細胞和血管內(nèi)皮細胞黏附，上調(diào)血管內(nèi)皮細胞CAMs的表達，致內(nèi)皮細胞功能紊亂，損傷VEC。阻斷或抑制ox－LD對內(nèi)皮細胞功能的損害，能有效預防、治療心血管疾病的發(fā)生、發(fā)展。

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