李紹彩，史富華，黃宇玲，張晉霞

心肌重構可導致心臟肥厚和心室壁僵硬度增加，最終心功能惡化引起心力衰竭。NADPH氧化酶在心血管疾病的發(fā)生和進展中具有重要作用，如內皮功能障礙、動脈粥樣硬化、糖尿病血管病變、腎素－血管緊張素－醛固酮系統(tǒng)（RAAS）相關的高血壓和缺血性血管重塑［1］。血管NADPH氧化酶激活產生的活性氧增多形成的氧化應激在心肌肥大發(fā)展過程中的重要作用也越來越受到重視。NADPH氧化酶的催化亞基Nox家族在心血管細胞中包含多個亞型，它們在不同病理刺激因素作用下介導不同的病理過程。他汀類藥物為羥甲基戊二酰輔酶A還原酶（HMG－CoA）抑制劑，是新一代調脂藥物。目前應用于臨床的主要有辛伐他汀（simvastatin，SIM）、洛伐他汀（lovastatin）、普伐他?。╬ravastatin）和阿托伐他?。╝torvastatin）等。他汀類除具有調脂作用外還具有其他多種作用，如改善內皮功能、改善血液流變學、抑制炎癥反應、穩(wěn)定斑塊、抑制平滑肌細胞增殖等作用，他汀類可以通過調節(jié)細胞因子的表達改善左室重塑。本研究通過腹主動脈結扎的方法復制心肌肥大模型，觀察壓力超負荷所致心肌肥大的過程中NADPH氧化酶不同Nox亞型的表達變化，以及辛伐他汀對壓力超負荷大鼠心肌NADPH氧化酶基因表達的作用，探索他汀類藥物抑制心肌肥大的可能機制。

1 材料與方法

1．1 動物 雄性SD大鼠220g～250g。由華北煤炭醫(yī)學院實驗動物中心提供。辛伐他汀為德國Merck Sharp＆Dohme公司生產原粉。DMEM培養(yǎng)基購自美國Gibco公司。二甲基亞砜（DMSO）、牛胰蛋白酶為美國Sigma公司產品，胎牛血清（FBS）為美國Gibco公司產品。RNA逆轉錄試劑盒及PCR試劑盒為美國Fermentas產品：TrizolReagent購自美國Invitrogen公司。

1．2 方法 腹主動脈縮窄模型（AC）建立。戊巴比妥鈉麻醉后固定，在分離的腹主動脈下方穿線，與－10號針頭結扎在一起，使腹主動脈形成環(huán)形縮窄。檢查結扎處，若搏動正常且腹后壁無出血，即可逐層縫合腹壁。肌注青霉素5×104U／只，以預防感染。假手術組除不結扎分離的腹主動脈外，其余操作均同手術組。術后常規(guī)飼養(yǎng)，正常飲水。

1．3 實驗分組 將動物隨機分為3組，每組10只。腹主動脈縮窄組（Model）；假手術組（Sham）；辛伐他汀組（SIM）：腹主動脈縮窄術后1h給予辛伐他汀，每日清晨灌胃10mg／（kg·d）。在術后6周測量各組動物體重及血壓，并進行相應指標的測定。

1．4 測定指標

1．4．1 心臟超聲心動圖 戊巴比妥鈉腹腔內注射麻醉，用Hp Sonos2500型多功能超聲檢查儀及7．5MHz相控陣探頭（美國惠普公司）檢測左室收縮末內徑（LVEDD）、舒張末內徑（LVESD）等，計算左室射血分數（LVEF）、短軸縮短率（LVFS）。1．4．2 血流動力學檢測 記錄左室收縮末壓（LVESP）、左室舒張末壓（LVEDP）及左室內壓最大上升、下降速率（±dP／dtmax）。

1．4．3 心肌肥大指數 各組動物摘取心臟。測量全心重、左心室重，計算心室重與體重比值（V／Bwt，Hermann Wilson’s公式）作為心肌肥大指數。

1．4．4 實時定量PCR法測定 Nox2、Nox4和p47phox的mRNA轉錄變化 。Trizol法提取心肌組織中的總RNA，測定總RNA純度，參照反轉錄試劑盒（德國Fermentas公司）說明書，取2μg總RNA樣本在10μL體系中進行逆轉錄反應。在20μL體系中擴增。Western印跡法檢測 Nox2、Nox4和p47phox的蛋白表達的變化。

1．5 統(tǒng)計學處理 采用SPSS13．0統(tǒng)計軟件，計量數據以均數±標準差（±s）表示，組間比較用單因素方差分析，兩兩比較用SNK法。

2 結 果

2．1 各組終點血壓測定 各組大鼠實驗終點進行血壓測定，Sham 組為107．16mmHg±7．03mmHg，Model組為171．47 mmHg±18．93mmHg，SIM 組為121．82mmHg±12．56mmHg。其中，Model組血壓較Sham組明顯升高（P＜0．01）；V／Bwt的測定中，Model組（3．87±0．34）較Sham組（2．11±0．12）明顯升高（P＜0．01），SIM 組 V／Bwt（2．23±0．76）較 Model組下降，造模成功。

2．2 超聲心動圖指標 與Sham組相比，Model組的LVEF、LVFS明顯降低（P＜0．01），而LVEDD、LVESD明顯增大（P＜0．01）；與 Model組相比，SIM 組的LVEF、LVFS明顯升高（P＜0．01），LVEDD、LVESD明顯下降（P＜0．01）。詳見表1。

表1 各組大鼠超聲心動圖指標（±s）

表1 各組大鼠超聲心動圖指標（±s）

與Sham組比較，1）P＜0．01；與 Madel組比較，2）P＜0．01

組別 n LVESD（mm） LVEDD（mm） LVEF（%） LVFS（%）Sham組 12 3．78±0．32 6．97±0．11 89．97±7．62 62．19±5．34 Model組 12 8．13±0．591） 9．82±0．391） 52．15±3．241） 27．29±7．661）SIM 組 12 5．48±0．622） 7．24±0．942） 78．93±6．772） 49．33±5．612）

2．3 血流動力學指標 與Sham組相比，Model組的±dp／dtmax、LVESP明顯降低 （P＜0．01），LVEDP明顯升高（P＜0．01）；與Model組相比，SIM 組±dp／dtmax、LVESP明顯升高（P＜0．01），LVEDP明顯降低（P＜0．01）。詳見表2。

表2 各組大鼠血流動力學指標（±s）

表2 各組大鼠血流動力學指標（±s）

與Sham組比較，1）P＜0．01；與 Model組比較，P＜0．01

組別 n LVESP（mmHg） LVEDP（mmHg） ＋dp／dtmax（mmHg／s） －dp／dtmax（mmHg／s）Sham組 12 120．17±10．01 5．12±0．99 5 021．07±221．17 4 198．23±143．21 Model組 12 84．32±6．941） 12．43±1．541） 3 301．27±190．111） 2 435．23±333．211）SIM 組 12 98．72±5．432） 7．33±1．082） 4 651．67±298．172） 3 298．12±201．112）

2．3 各組Nox2、Nox4和p47phox表達的變化 與Sham組相比，Model組的大鼠心肌中Nox2、Nox4和p47phoxmRNA及蛋白表達升高（P＜0．01）；SIM組較 Model組心肌中Nox2、Nox4和p47phoxmRNA及蛋白表達明顯下降（P＜0．01）。詳見圖1、圖2。

圖1 Rail time－PCR法檢測心肌組織中Nox2、Nox4和p47phox表達

圖2 Western blot法檢測心肌組織中Nox2、Nox4和p47phox表達

3 討 論

心肌肥厚是心臟對機械負荷及神經體液因子改變的代償性反應，是發(fā)生心肌缺血、心律失常的獨立危險因子［2］，氧化應激在心臟病變中起重要作用［3－7］。氧化應激是由于機體細胞產生活性氧（ROS）增多，超過了體內抗氧化系統(tǒng)的消除能力所導致的氧化還原狀態(tài)的失平衡［8］。高血壓、動脈粥樣硬化、糖尿病血管病變、心衰等心血管疾病病理發(fā)展過程中ROS主要來源于血管NADPH氧化酶，其與巨噬細胞NADPH氧化酶在結構上很相似，但表達和調節(jié)上又有很多區(qū)別［9，10］。NADPH氧化酶是體內唯一被發(fā)現的主要功能是產生ROS的酶，它對許多氧化還原敏感的信號通路有非常重要的作用。NADPH氧化酶產生的ROS可以使一氧化氮合酶（NOS）失偶聯，還能激活黃嘌呤氧化酶，產生更多的ROS，使氧化應激放大［11］。心血管NADPH氧化酶的催化亞基是不同的Nox同系物和p22phox，它們組成膜復合體細胞色素b558，位于胞漿顆粒和漿膜上；調節(jié)亞基包括p47phox、p67phox、p40phox和Rac，它們可組成另一個蛋白復合體，存在于胞漿。NADPH氧化酶可被多種病理生理刺激因子通過不同的Nox亞基特異性激活，產生不同的下游效應［8，9，12］。心血管系統(tǒng)中主要有 Noxl、Nox2、Nox4，Nox2在內皮細胞（ECs）、成纖維細胞、心肌細胞中豐富表達；Noxl在血管平滑肌細胞（VSMCs）中高表達，但在ECs和心肌細胞中未發(fā)現；Nox4表達廣泛，在ECs和心肌細胞中均高表達。不同的心血管疾病病理因子，如血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）、細胞因子、機械張力等，刺激不同的Nox亞型激活，不同的Nox亞型激活后啟動病理變化也可能不同。Nox2型NADPH氧化酶在AngⅡ依賴性的心肌細胞肥大、心內膜纖維化，以及壓力超負荷型左心肥厚（LVH）誘發(fā)的心臟收縮失常等發(fā)展過程中起重要的介導作用。而壓力超負荷所致的心肌細胞肥大卻可能與Nox4有關［13，14］。

阿托伐他汀可以抑制同型半胱氨酸（Hcy）誘導的NADPH氧化酶活性，通過抑制重要的NADPH氧化酶Noxl亞基mRNA的表達、抑制內皮Nox4過表達和形成有活性的p22phox復合體而發(fā)揮細胞的抗氧化作用［15］。黎健等［16］研究顯示高濃度（0．8g／L）LDL刺激 HUVEC時，Nox4表達上凋，細胞內 ROS生成增加。用辛伐他汀預處理再加高濃度LDL刺激時，Nox4表達下降，ROS生成量減少。提示辛伐他汀可下調HUVEC中Nox4的表達，降低ROS水平，進一步在體內證明辛伐他汀的抗氧化作用。

本研究結果表明，壓力超負荷性所致心肌肥大過程中NADPH氧化酶亞型Nox2、Nox4和調節(jié)亞基p47phox基因及蛋白水平均增高，而辛伐他汀的干預可逆轉這種增高，進而抑制ROS產生信號系統(tǒng)，導致NADPH氧化酶活性降低，改善肥大心肌的功能。他汀類藥物具有獨立于降脂作用以外保護肥大心肌細胞的作用。

［1］ Care A，Brewer AC，Narayanapanicker A，et al．NADPH oxidases in cardiovascular health and disease［J］．Antioxid Redox Signal，2005，8（5－6）：691－728．

［2］ Azzouzi H，Dewindt LJ．Heart spotting［J］．Basic Res Cardiol，2008，103（3）：228－231．

［3］ McMurray J，Chopra M，Abdullah I，et al．Evidence of oxidative stress in chronic heart failure in humans［J］．Eur Heart J，1993，14（11）：1493－1498．

［4］ Keith M，Geranmayegan A，Sole MJ，et al．Increased oxidative stress in patients with congestive heart failure［J］．J Am Coll Cardiol，1998，31（6）：1352－1356．

［5］ Hare JM，Stamler JS．NO／redox disequilibrium in the failing heart and cardiovascular system［J］．J Clin Invest，2005，115（3）：509－517．

［6］ Murdoch CE，Zhang M，Cave AC，et al．NADPH oxidasedependent redox signalling in cardiac hypertrophy，remodelling and failure［J］．Cardiovasc Res，2006，71（2）：208－215．

［7］ Takimoto E，Kass DA．Role of oxidative stress in cardiac hypertrophy and remodeling［J］．Hypertension，2007，49（2）：241－248．

［8］ Molavi B，Mehta JL．Oxidative stress in cardiovascular disease：Molecular basis of its deleterious effects，its detection，and therapeutic considerations［J］．Curt Opin Cardiol，2004，19（5）：488－493．

［9］ Madamanchi N，Vendrov A，Runge MS．Oxidative stress and vascular disease［J］．Arterioscler Thromb Vase Biol，2005，25（1）：29－38．

［10］ Morawietz H，Bornstein SR．Leptin，endothelin，NADPH oxidase，and heart failure［J］．Hypertension，2006，47（5）：e20．

［11］ Landmesser U，Dikalov S，Price SR，et al．Oxidation of tetrahydrobiopterin leads to uncoupling of endothelial cell nitric oxide synthase in hypertension［J］．J Clin Invest，2003，111：1201－1209．

［12］ Cai H，Griendling KK，Harrison DG．The vascular NAD（P）H oxidases as therapeutic targets in cardiovascular［J］．Sciences，2003，24：471－478．

［13］ Bendall JK，Cave AC，Heymes C，et al．Pivotal role of a gp91phoxeontaining NADPH oxidase in angiotensin Ⅱ －induced cardiac hypertrophy in mice［J］．Circulation，2002，105：293－296．

［14］ Johar S，Cave AC，Narayanapanicker A，et al．Aldosterone mediates angiotensinⅡ－induced interstitial cardiac fibrosis via a Nox2－containing NADPH oxidase［J］．Faseb J，2006，20（9）：1546－1548．

［15］ Bao XM，Wu CF，Lu GP．Atorvestatin attenuates homoeysteine induced apoptesis in human umbilical vein endothelial cells via inhibiting NADPH oxidase－related oxidative stress－triggered p38MAPK signaling［J］．Acta Pharmacol Sin，2009，30（10）：1392－1398．

［16］ 黎健，高丹．NADPH氧化酶源性活性氧在糖尿病及其血管并發(fā)癥發(fā)生中的作用機制［J］．中國動脈硬化雜志，2009，17（7）：562－564．