胡志希，胡思遠(yuǎn)，李 琳，李 杰，凌 智，侯 超

冠心?。╟oronary heart disease，CHD）屬中醫(yī)“胸痹”范疇，究其病因有血瘀、痰阻、寒凝、氣滯之別，但其基本病機(jī)則是“心脈不通”，血瘀證是冠心病中最常見的證型之一［1－3］。如果CHD的發(fā)病年齡較輕（男性≤55歲，女性≤65歲）稱為早發(fā)CHD［4］。研究早發(fā)CHD血瘀證與血管緊張素轉(zhuǎn)換酶（ACE）基因多態(tài)性的相關(guān)關(guān)系以及對(duì)血管內(nèi)皮功能的影響，明確早發(fā)CHD血瘀證的分子遺傳學(xué)特征，具有非常重要的意義。

1 資料與方法

1．1 診斷標(biāo)準(zhǔn) 符合1979年 WHO缺血性心臟病“心絞痛”、“心肌梗死”診斷標(biāo)準(zhǔn)，以患者臨床癥狀、體征和病史結(jié)合心電圖改變或冠脈造影（CAG）進(jìn)行診斷。以男性≤55歲，女性≤65歲患有冠心病者為早發(fā)冠心病。

按照1995年《中華人民共和國中醫(yī)藥行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)·中醫(yī)病證診斷標(biāo)準(zhǔn)》的辨證分型標(biāo)準(zhǔn)［5］；1997年《中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)·中醫(yī)臨床診療術(shù)語·證候部分》［6］；2002年國家中醫(yī)藥管理局醫(yī)政司胸痹急癥中國中醫(yī)藥學(xué)會(huì)內(nèi)科學(xué)會(huì)心病專業(yè)委員會(huì)《中醫(yī)心病診斷療效標(biāo)準(zhǔn)與用藥規(guī)范》［7］。主癥：胸悶心痛，痛如針刺；兼癥：面色晦暗／口唇青紫／爪甲發(fā)青；舌象：舌質(zhì)紫暗／舌有瘀斑；脈象：細(xì)澀／結(jié)代。主癥1項(xiàng)＋次癥2項(xiàng)＋舌脈1項(xiàng)，為心血瘀阻證。

1．2 納入標(biāo)準(zhǔn) 發(fā)病時(shí)年齡男性≤55歲，女性≤65歲；湖南地區(qū)出生；漢族；彼此無血緣關(guān)系。

1．3 排除標(biāo)準(zhǔn) 嚴(yán)重高血壓，糖尿病，惡性腫瘤，肝腎疾病、甲狀腺病患者。下列各種心臟?。禾悄虿⌒孕募〔　⒓谞钕俟δ芸哼M(jìn)性心臟病、高血壓性心臟病、肺源性心臟病、貧血性心臟病、系統(tǒng)性硬皮病性心臟病、風(fēng)濕性心臟病。

1．4 研究對(duì)象 早發(fā)冠心病組選擇湖南中醫(yī)藥大學(xué)附一院、附二院的住院患者。早發(fā)CHD血瘀證組41例，男25例，女16例，年齡（57．21±4．15）歲；早發(fā)CHD非血瘀證組45例，男28例，女17例，年齡（58．58±4．09）歲。正常對(duì)照組38名，男21名，女17名，年齡（59．71±4．18）歲。經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析3組間性別、年齡比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0．05），具有可比性。

1．5 臨床指標(biāo)檢測(cè) 采用南京建成生物工程研究所eNOS試劑盒（硝酸還原酶法）測(cè)定eNOS；采用北京普爾偉業(yè)生物科技有限公司血漿內(nèi)皮素（ET）放射免疫藥盒（放射免疫分析法）測(cè)定。

1．6 DNA提取 參照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》［8］傳統(tǒng)酚抽提法提取血樣中的DNA。

1．7 DNA純度及濃度的確定 用移液槍吸取DNA溶液5μL至1．5mL EP管，用去離子水稀釋至80μL；用紫外分光光度計(jì)分別測(cè)量波長(zhǎng)260nm及280nm時(shí)的OD值，確定DNA的純度和濃度；根據(jù)測(cè)得的DNA濃度將其稀釋成約80ng／μL。當(dāng)OD1／OD2在1．7～2．0，表明提取的DNA符合要求。

1．8 聚合酶鏈反應(yīng)引物擴(kuò)增（PCR） ①引物設(shè)計(jì)參照Rigat［9］，引物1：5’－CTG GAG ACC ACT CCC ATC CTT TCT－3’；引物2：5’－GAT GTG GCC ATC ACA TTC GTC AGA T－3’，由上海捷瑞生物工程有限公司合成。②反應(yīng)體系：2×Taq MasterMix1）25μL；引物1：1．5μL（37．5Pmol）；引物2：1．5μL（37．5Pmol）；模板：5μL；ddH2O：17μL；總體積：50μL；Taq酶：100 U／mL dNTPs 400Um MgCl24mol／L Reaction buffer。③反應(yīng)參數(shù)：輕微搖勻，微量離心機(jī)離心后，加液狀石蠟20μL，放置PCR儀上，94℃變性4min，然后80℃以微量加樣器插入液狀石蠟油面下加入Taq酶2U。每個(gè)循環(huán)為94℃變性1min，58℃復(fù)性1min，72℃延伸1min 30s，共30個(gè)循環(huán)，72℃延伸10 min。循環(huán)完畢，取出PCR管，放置4℃待測(cè)。④PCR產(chǎn)物鑒定及分型：人類ACE基因包含26個(gè)外顯子及25個(gè)內(nèi)含子，在16內(nèi)含子中存在或缺失287bP的DNA片斷可導(dǎo)致插入（I）或缺失（D）的存在，DNA組也出現(xiàn)3種相應(yīng)的ACE基因型，即ⅠⅠ、ID、DD［10］。若在190bP左右出現(xiàn)一條帶為DD型，在490bP出現(xiàn)一條帶為II型，同時(shí)具有190bP、490bP兩條帶為ID型。1．9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS15．0統(tǒng)計(jì)軟件包分析?；蛐图暗任换蝾l率采用頻數(shù)計(jì)算法。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差±s）表示，兩組間均數(shù)比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料組間比較用χ2檢驗(yàn)或Fisher精確概率檢驗(yàn)。計(jì)算比值比（OR）及95%可信區(qū)間（95%CI），檢驗(yàn)水平a＝0．05。

2 結(jié) 果

2．1 各組臨床資料比較（見表1） 血瘀證組、非血瘀證組總膽固醇（TC）、低密度脂蛋白（LDL－C）與正常對(duì)照組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05），血瘀證組存在明顯的脂質(zhì)代謝失常，這與以往的研究相符合。在發(fā)現(xiàn)的18例有冠心病家族史患者中，14例屬血瘀證，通過χ2檢驗(yàn)，血瘀證組和非血瘀證有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05），血瘀證具有明顯的遺傳傾向。各組間性別、年齡、體重指數(shù)（BMI）、收縮壓（SBP）、舒張壓（DBP）、血糖（BS）、高密度脂蛋白（HDL－C）均相近似（P＞0．05）。冠心病家族史早發(fā)冠心病血瘀證14例，早發(fā)冠心病非血瘀證4例。

表1 3組間各項(xiàng)臨床資料比較

2．2 ACE基因基因型及等位基因頻率分布 3組ACE基因型分布符合 Hardy－Weinberg平衡（P＞0．05），表明樣本來源于同一人群，具有一定代表性。其中在早發(fā)CHD血瘀證組：II基因型6例，ID基因型9例，DD基因型26例；早發(fā)CHD非血瘀證組：II基因型15例，ID基因型18例，DD基因型12例；正常對(duì)照組：II基因型23名，ID基因型11名，DD基因型4名。正常對(duì)照組、早發(fā)CHD血瘀證組、早發(fā)CHD非血瘀證組3組相比，ACE基因基因型及等位基因頻率分布有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05）。血瘀證組DD基因型及D等位基因頻率高于非血瘀證及正常對(duì)照組。而II基因型及I等位基因頻率明顯低于非血瘀證及正常對(duì)照組。非血瘀證組基因型分布與正常對(duì)照組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05），但等位基因頻率與正常對(duì)照組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0．05）。正常對(duì)照組與冠心病組相比，在基因型分布和等位基因頻率分布兩方面均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05）。詳見表2。

表2 ACE基因I／D基因多態(tài)性基因型及等位基因頻率分布 例（%）

2．3 不同ACE基因型攜帶者發(fā)生早發(fā)CHD血瘀證的OR值

血瘀證患者與各組相比，DD基因型OR值均大于3，且95%CI區(qū)間不含1，表明DD型基因與早發(fā)CHD血瘀證發(fā)生關(guān)系密切，早發(fā)CHD患者DD型基因攜帶者易發(fā)生血瘀證。詳見表3。

2．4 三組ET、NO及ET／NO比較 早發(fā)CHD血瘀證組ET與早發(fā)CHD非血瘀證組、正常對(duì)照組有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05或P＜0．01），血瘀證明顯高于對(duì)照組和非血瘀證。NO測(cè)值各組之間相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。ET／NO以血瘀證最高，血瘀證與正常對(duì)照組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．01）。詳見表4。

表3 DD基因型攜帶者發(fā)生早發(fā)CHD血瘀證OR值

表4 三組NO、ET及ET／NO比較（±s）

表4 三組NO、ET及ET／NO比較（±s）

與正常對(duì)照組比較，1）P＜0．05；與正常對(duì)照組比較，2）P＜0．01；與非血瘀證組比較，3）P＜0．05

組別 n ET（pg／mL） NO（μmol／L） ET／NO早發(fā)CHD血瘀證組 41 71．15±17．182）3） 152．37±29．27 0．50±0．132）早發(fā)CHD非血瘀證組 45 66．34±12．341） 145．18±18．60 0．47±0．09正常對(duì)照組 38 54．49±8．06 155．29±25．24 0．38±0．08

2．5 3組不同ACE基因型的ET／NO比較 對(duì)124例受檢者各基因型間ET／NO分析結(jié)果表明，DD基因型ET／NO與ID、II基因型間相比均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．01），以DD基因型最高。三組間ET／NO值均以DD最高，其中以血瘀證最高。早發(fā)CHD血瘀證與正常對(duì)照組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．01），與非血瘀證組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0．05），血瘀證ID基因型患者的ET／NO值與非心血瘀證組和正常對(duì)照者相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05）。詳見表5。

表5 3組不同ACE基因型的ET／NO比較（±s）

表5 3組不同ACE基因型的ET／NO比較（±s）

與CHD非心血瘀阻證組比較，1）P＜0．05；與正常對(duì)照組比較，2）P＜0．05，3）P＜0．01；與組內(nèi)DD基因型比較，4）P＜0．01

組別 II n ET／NO ID n ET／NO DD n ET／NO早發(fā)CHD血瘀證組 6 0．53±0．234） 9 0．59±0．121）2）4） 26 0．68±0．153）早發(fā)CHD與非血瘀證組 15 0．51±0．274） 18 0．55±0．14 12 0．66±0．19正常對(duì)照組 23 0．50±0．18 11 0．50±0．25 4 0．59±0．13全體受檢者 44 0．52±0．20 38 0．55±0．19 42 0．61±0．28

3 討 論

3．1 ACE基因多態(tài)性與早發(fā)CHD的關(guān)系 人類的ACE基因?qū)賳慰截惢?，定位于染色體17q23上，長(zhǎng)21Kb，由26個(gè)外顯子和25個(gè)內(nèi)含子組成。近年來發(fā)現(xiàn)人類ACE基因存在插入／缺失多態(tài)性，即以其第16內(nèi)含子中一長(zhǎng)為287bp的Alu片段的有無為標(biāo)志，分為插入（I）和缺失（D）兩種等位基因和DD型（純合子）、II型（純合子）和ID型（雜合子）三種基因型。本項(xiàng)研究表明，早發(fā)CHD患者DD基因型及D等位基因頻率明顯高于正常對(duì)照組，與文獻(xiàn)報(bào)道一致［11－13］，且 DD基因型OR 值為14．73（χ2＝23．42，95%CI為4．37～49．68，P＜0．01），說明 DD基因型可能與早發(fā)冠心病發(fā)生相關(guān)。

3．2 ACE基因I／D多態(tài)性與血清ACE、ET／NO的關(guān)系 以血漿ET與NO比值作為內(nèi)皮細(xì)胞功能指標(biāo)對(duì)二者關(guān)系進(jìn)行了探討，結(jié)果表明ET／NO比值DD型比II型明顯升高（P＜0．05）［14］。ACE DD基因型患者 ET／NO 比值升高，認(rèn)為這是ACE引起冠脈痙攣的另一重要作用機(jī)制［15］。本項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，早發(fā)CHD血瘀證組、早發(fā)CHD非血瘀證組與正常對(duì)照組相比，血中ET、ET／NO相比均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05），早發(fā)CHD血瘀證患者血漿ET含量明顯升高，NO血清含量無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。通過對(duì)各組不同基因型ET／NO綜合分析表明，在整個(gè)觀察對(duì)象中以DD型ET／NO最高，各組之間也均以DD型ET／NO比值最高。且血瘀組DD基因型NO／ET明顯高于非血瘀組、正常對(duì)照組，進(jìn)一步說明早發(fā)CHD血瘀證的發(fā)病可能與ACE基因多態(tài)性分布密切相關(guān)。

3．3 早發(fā)CHD血瘀證與ACE基因多態(tài)性分布的關(guān)系 ACE基因I／D多態(tài)性與冠脈病變嚴(yán)重程度相關(guān)，且DD及D等位基因的頻率隨冠脈病變程度的加重而升高［16］。本項(xiàng)研究結(jié)果顯示正常對(duì)照組、早發(fā)CHD非血瘀證組、早發(fā)CHD血瘀證組中的D等位基因頻率分別為19%、42%、61%，DD基因型比例分別為4%、12%、26%，呈逐漸增高趨勢(shì)，三組相比DD型基因及D等位頻率有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．01）。血瘀證組DD型基因及D等位頻率明顯高于非血瘀證組（OR＝4．76，95%CI：1．90～11．92，P＜0．01）及正常對(duì)照組（OR＝14．73，95%CI：4．37～4 9．68，P＜0．01），與整個(gè)觀察對(duì)象相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（OR＝3．38，95%CI：1．62～7．07，P＜0．01）。DD型等位基因可能為早發(fā)CHD血瘀證候選的標(biāo)志基因，但尚需進(jìn)一步擴(kuò)大樣本數(shù)進(jìn)行驗(yàn)證。同時(shí)尚需進(jìn)一步進(jìn)行血瘀證家系遺傳學(xué)研究加以證實(shí)。

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