舒 剛，黃 春，楊 樂，張 偉，符華林

（四川農業(yè)大學動物醫(yī)學院，四川 雅安625014）

葛根芩連制劑來源于《傷寒論》中葛根黃芩黃連湯［1］：葛根半斤，炙甘草二兩，黃芩三兩，黃連三兩，上四味，以水八升一，先煮葛根減二升，內諸藥，煮取二升，去淬，分溫再服。葛根芩連湯是《傷寒論》中治療濕熱證的經典方劑，具有解表清里，升清止痢之功效［2］。葛根芩連湯是在獸醫(yī)臨床治療濕熱下痢、細菌腹瀉等大腸濕熱證的常用中藥制劑，其有效成分確切、療效明顯，應用成熟。目前，葛根芩連湯在人用藥領域已經被制備成為多種劑型，如供口服的片劑、配方顆粒、滴丸、微丸及通過其他途徑給藥的巴布劑和結腸定位釋藥柱塞膠囊等［3］。但在獸藥領域，除了傳統(tǒng)的湯劑和散劑外，很少有其他劑型的報道。為了開發(fā)臨床療效更為確實的葛根芩連復方制劑，本文從葛根芩連注射劑制備的提取工藝開展研究，采用正交試驗法［4］，以提取液澄明度和葛根素、黃芩苷、鹽酸小檗堿的含量作為考察指標，對葛根芩連湯的提取方法進行考察，篩選出最佳提取工藝，以豐富葛根芩連的制劑研究內容，為獸醫(yī)臨床提供新型的葛根芩連制劑奠定基礎。

1 儀器與試藥

1．1 儀器 UV21012P型紫外分光光度計（尤尼可（上海）儀器有限公司）；HS－120D超聲波清洗機（上海新芝生物技術研究所）；Elix／RiOs純水系統(tǒng)（法國密理博中國有限公司）；電子天平（Sartorius，BS110S）；冷凍離心機（美國科峻儀器公司）；PHS－25型酸度計（成都方舟科技開發(fā)公司）；HJ－4多頭磁力加熱攪拌器（常州國華電器有限公司）

1．2 藥材及試劑 葛根（Puerariathomsonii Benth）；黃芩（ScutellariabaicalensisGeorgi）；黃連（CoptischinensisFranch）；甘草（Glycyrrhiza uralensisFisch）（以上藥材均購自四川雅安市三九中藥材公司）；葛根素（110752－200511），黃芩苷（110715－200815），鹽酸小檗堿（110713－200515）（均購自中國藥品生物制品檢定所）。

2 試驗方法

2．1 葛根、黃芩、黃連有效成分含量測定方法的建立 葛根、黃芩、黃連中有效成分分別為葛根素、黃芩苷、鹽酸小檗堿。其含量采用紫外分光光度法［5－6］測定。

2．1．1 標準品溶液的制備 精密稱取各標準品適量，用75%乙醇完全溶解于25mL容量瓶中，搖勻，備用。

2．1．2 紫外最大吸收波長的確立 取各標準溶液，以75%乙醇為空白，在200～400nm范圍內掃描。2．1．3 標準曲線的制備 分別精密移取各標準品溶液1．0、2．0、3．0、4．0、5．0mL至25mL容量瓶中，用75%乙醇配制刻度，在相應波長下以吸光度A對濃度C（mg／mL）繪制標準曲線，并計算回歸方程。

2．1．4 精密度試驗 儀器精密度：精密吸取各標準品溶液5份，在相應波長下測定吸光度，計算相對標準差RSD。

2．1．5 穩(wěn)定性試驗 取各標準樣品溶液，分別在0、2、4、6、8h內對其吸光度進行測定。

2．1．6 葛根素、黃芩苷、鹽酸小檗堿的含量測定將提取液均濃縮至25mL，于4℃靜置沉淀24h后，取上清液5mL于3 000r／min離心15min后，取上清液2mL于25mL容量瓶中，用75%乙醇補足；取稀釋液分別置于相應波長下檢測葛根素、黃芩苷、鹽酸小檗堿的含量。

2．2 葛根、黃芩、黃連單味藥有效成分的提取 稱取葛根、黃芩、黃連適量，粉碎粗粉，純水作為提取溶劑，采取煎煮法提取各單味藥的有效成分［7］。以不同條件下提取的各溶液中葛根素、黃芩苷、鹽酸小檗堿的含量為指標，按照正交試驗L9（34）設計，考察料液比（7、9、11）、提取時間（30、60、90min）、提取次數（1、2、3）對有效成分提取率的影響，見表1。

表1 L9（34）正交設計表

2．3 提取方法的篩選 為簡化提取工藝，將方中藥味進行組合，以期找出可以混合提取的藥味。將提取液組合后沉淀的量作為組合的依據，篩選可以組合提取的藥味，以簡化工藝。

2．3．1 提取液組合方法 按處方量稱取葛根、黃芩、黃連、甘草分別為15g、9g、9g、6g；分別提取各味藥。方法為水煎煮2次，每次1．5h。各提取液均濃縮至25mL。取各單味藥提取液適量，4℃靜置2 h，于3 000r／min離心15min，取上清液相互組合，每次組合時上清液均取5mL，每個組合平行測定3次。（葛根提取液為A，黃芩提取液為B，黃連提取液為C，甘草提取液為D），組合方式為：AxB，AxC，AxD，BxC，BxD，CxD，AxBxC，AxBxD，AxCxD，BxCxD，AxBxCxD

2．3．2 沉淀量的考察 將配伍后的溶液攪拌均勻，4℃靜置2h，3 000r／min離心15min后用干燥至恒重的定量濾紙減壓抽濾，將收集的沉淀于50℃恒溫減壓干燥箱中干燥36h后，取出在電子天平上測定沉淀的量。

3 結果與分析

3．1 紫外最大吸收波長的確立和標準曲線的制備

3．1．1 葛根素標準品在251±1nm處有最大吸收，標準對照品掃描圖見圖1。葛根素標準品溶液在251nm波長下以吸光度A對濃度C（mg／mL）繪制標準曲線，回歸方程為 Abs＝0．150500C－0．015800，R2＝0．9995（n＝5）；表明葛根素在6．4～32．0μg／mL范圍內有良好的線性關系，如圖2。

3．1．2 黃芩苷標準品在280±1nm處有最大吸收，標準對照品掃描圖見圖3。黃芩苷標準品溶液在278nm波長下以吸光度A對濃度C（mg／mL）繪制標準曲線，回歸方程為 Abs＝0．129063C－0．018500，R2＝0．9996（n＝5）；表明黃芩苷在6．4～32．0μg／mL范圍內有良好的線性關系，如圖4。

3．1．3 鹽酸小檗堿標準品在266±1nm和349±1 nm處有最大吸收，且349nm處的吸收度大于266 nm處，標準對照品掃描圖見圖5。鹽酸小檗堿標準品溶液在349nm波長下以吸光度A對濃度C（mg／mL）繪制標準曲線，回歸方程為Abs＝0．058589C－0．002190，R2＝0．9997（n＝5）；表明鹽酸小檗堿1．60～8．00μg／mL范圍內有良好的線性關系。如圖6。

3．2 精密度試驗 葛根素、黃芩苷、鹽酸小檗堿標準品溶液的相對標準差RSD分別為0．46%、1．07%、2．63%。

3．3 穩(wěn)定性試驗 葛根素標準樣品溶液測定結果的RSD達到0．93% ，表明葛根素乙醇溶液至少在8h內穩(wěn)定。

黃芩苷標準樣品溶液測定結果的RSD達到2．01%，表明黃芩苷的乙醇溶液至少在8h內穩(wěn)定。

鹽酸小檗堿標準樣品溶液測定結果的RSD達到1．43% ，表明鹽酸小檗堿的乙醇溶液至少在8h內穩(wěn)定。

3．4 葛根素、黃芩苷、鹽酸小檗堿的提取

3．4．1 葛根有效成分的提取結果如表2所示。由表2得知，各因素對于提取率的影響大小依次為C B A，最優(yōu)組合為A3B3C3?？梢娞崛〈螖禐橛绊懜鸶靥崛÷实淖钪饕蛩?，而用水量對葛根素的提出率影響較小。從結果看，提取2次和3次葛根素提取率差別不大，考慮到時間和成本，選擇A3B3C2為最佳工藝，即加11倍量水，提取兩次，每次1．5h。

表2 L9（34）正交試驗數據及其計算分析結果（葛根素）

3．4．2 黃芩中有效成分提取結果如表3所示。由表3得知，各因素對于黃芩苷提取率的影響大小依次為C B A，提取次數為影響黃芩苷提取率的最主要因素，最優(yōu)組合為A3B3C3。從結果看，提取2次和3次黃芩苷的提取率差別不大，考慮到時間和成本，選擇A3B3C2為最佳工藝，即加11倍量水，提取兩次，每次1．5h。

表3 L9（34）正交試驗數據及其計算分析結果（黃芩苷）

3．4．3 黃連中有效成分的提取結果如表4所示。由表4得知，各因素對于鹽酸小檗堿提取率的影響大小依次為C B A，最優(yōu)組合為A3B3C3。從結果可以看出，2次和3次提取對鹽酸小檗堿的提取率差別不大，考慮到時間和成本，選擇A3B3C2為最佳工藝，即加11倍量水，提取兩次，每次1．5h。

表4 L9（34）正交試驗數據及其計算分析結果（鹽酸小檗堿）

3．5 提取方法的篩選結果

3．5．1 沉淀量的考察 由結果表5可以看出，ABCD項和BCD項的配伍產生的沉淀量最多。原因可能為黃芩苷為黃酮的葡萄糖醛酸苷，甘草酸為五環(huán)三萜的葡萄糖醛酸苷，均有一定的酸性，與鹽酸小檗堿反應而產生沉淀，有效成分的含量有所降低；AB、AC、AD、BD、ABD組合后沉淀量產生小，有效成分減少量少。

表5 組合結果

3．5．2 提取方法的確定 從各有效成分組合后產生沉淀的情況看，盡管AB、AC、AD、BD組合產生的沉淀較少，但組合后余下的兩種藥物組合仍會產生較多沉淀，而ABD組合后余下的一味藥物黃連單獨提取不會影響其他成分的提取。因此，根據藥味組合提取后的沉淀量，結合制備的簡便性和節(jié)約成本、時間；確立提取方法為：葛根、黃芩、甘草合并提取，黃連單獨提取。

4 討論

4．1 在考察提取時間、料液比、提取次數對有效成分的影響時，采用紫外分光光度法測定葛根素、黃芩苷、鹽酸小檗堿的含量，該方法簡便、易操作，結果重現(xiàn)性好，可以作為單味藥提取液中有效成分含量考察的方法。

4．2 影響葛根素、黃芩苷、鹽酸小檗堿提取率的主要因素為提取次數，其次為提取時間，而料液比對提取率的影響不大。同時，提取液組合結果顯示，葛根和黃芩、葛根和黃連、葛根和炙甘草、黃芩和炙甘草組合后沉淀量較少，黃芩和黃連、黃連和炙甘草組合后產生的沉淀量較多；因此，確定最佳的提取工藝為葛根、黃芩、炙甘草3味藥混合提取，而黃連單獨提?。惶崛」に嚲鶠?1倍量的水、提取2次、每次1．5h。

［1］ 李培生，劉渡舟．傷寒論［M］．北京：人民衛(wèi)生出版社，1985：114－116．

［2］ 李宇銘．論葛根芩連湯并非表里同治［J］．光明中醫(yī)，2008，23（3）：374－375．

［3］ 王立，經典方劑葛根芩連湯研究現(xiàn)狀［J］．黑龍江醫(yī)藥雜志，2009，22（2）：172－173．

［4］ 李君富，尹蓉莉，李肖屹，等．正交試驗優(yōu)選葛根芩連湯提取工藝［J］．中國藥房，2009，20（27）：2114－2116．

［5］ 張玲，徐新剛，時延增，等．紫外分光光度法測定柴黃口服液中黃芩苷的含量［J］．中草藥，1997，28（2）：86－87．

［6］ 唐小明．紫外分光光度法測定清開靈注射液中黃芩苷的含量［J］．海峽藥業(yè)，2001，13（1）：33－34．

［7］ 楊穎．探討中藥煎煮法［J］．中國醫(yī)藥導報，2009，6（10）：229．