王 鋼，宋九華，伏秦超，任偉毅

（樂山師范學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，四川 樂山614004）

古代醫(yī)學(xué)認(rèn)為，甘草慎與大戟、海藻、芫花和甘遂配伍，屬于“十八反”之列［1］?！对喁燅R集》中甘草相關(guān)的十八反歌訣為：“大戟芫花并海藻，甘遂以上反甘草，若還吐逆及翻腸，尋常犯之都不好”?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)證明“十八反”配伍在特定的病理生理條件下，往往會產(chǎn)生對機體不利的不良反應(yīng)，有時會增加毒性，有的是對方劑本身或其他藥物的療效產(chǎn)生干擾、拮抗乃至抵消。大戟、甘遂、芫花和海藻均為有毒中藥，試驗證明甘草中的某些成分具有使其他配伍藥物的某些有毒成分增加溶解度的作用，但大戟、海藻、芫花和甘遂與甘草的配伍對甘草主要藥理成分的影響鮮見報告［2－4］。故本試驗擬以甘草主要藥理成分為評價指標(biāo)，探討不同“反藥”配伍對甘草主要藥理成分的影響，為“十八反”在獸醫(yī)中的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1．1 儀器 LC－2010A高效液相色譜儀（日本島津）配紫外檢測器；色譜柱：Shim－pack VP18柱（150 mm×4．6mm，5μm）；FC204型電子分析天平（上海精科天平）；KQ－50B型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司，）。

1．2 試驗藥品 生甘草、大戟、海藻、芫花和甘遂為藥用飲片，購自樂山市中藥材公司；異甘草素、甘草苷、甘草酸單銨鹽、甘草次酸等標(biāo)準(zhǔn)品，購自上海融禾醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司；乙醇、冰醋酸、醋酸銨、磷酸、濃鹽酸、三氯甲烷等均為國產(chǎn)分析純，乙腈、甲醇為國產(chǎn)HPLC色譜純，所有化試藥物均用0．22μm濾膜過濾備用；水為自制重蒸水。

1．3 試驗方法

1．3．1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 將異甘草素、甘草苷、甘草酸單銨鹽和甘草次酸分別按表1所述進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制。

表1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

1．3．2 儀器工作條件 通過試驗，確定HPLC儀的最佳工作條件，具體的參數(shù)如表2所示。

表2 儀器工作條件

1．3．3 待檢溶液的制備 稱取大戟、海藻、芫花和甘遂0．5g四味藥分別與0．5g的生甘草混合，分別置于不同三角瓶中，共4份。

1．3．3．1 異甘草素和甘草苷 在上述混合樣品中分別加入10mL 50%乙醇，80℃水浴20min，超聲（50℃，300W）提取10min，過濾，濾液經(jīng)0．22μm微孔濾膜過濾，即得異甘草素、甘草苷待檢溶液。

1．3．3．2 甘草酸單銨 在上述混合樣品中加入40 mL蒸餾水，煮沸，再沸水浴20min，超聲（50℃，300 W）提取10min，過濾，濾液經(jīng)0．22μm微孔濾膜過濾，即得甘草酸單銨待檢溶液。

1．3．3．3 甘草次酸 在上述混合樣品中加入濃鹽酸5mL，再加入三氯甲烷20mL，超聲（50℃，300 W）提取2次，每次10min，合并三氯甲烷液，過濾。濾液蒸干，加入10mL甲醇溶解，經(jīng)0．22μm微孔濾膜過濾，即得甘草次酸待檢溶液。

1．3．4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 按HPLC儀的最佳工作條件分別對甘草中的4個主要藥理成分分別進(jìn)樣2次進(jìn)行檢測，記錄色譜圖，將平均峰面積Y對進(jìn)樣量X進(jìn)行線性回歸，并分別計算出線性方程。

2 結(jié)果與分析

2．1 方法的專屬性考察 在上述的色譜條件下，將對照品、供試品、甘草陰性對照等溶液注入HPLC色譜儀，結(jié)果顯示陰性對照無干擾。

2．2 線性關(guān)系考察 通過對平均峰面積Y對進(jìn)樣量X進(jìn)行線性回歸，分別計算出各主要成分含量的線性方程。結(jié)果見表3。

表3 回歸方程

2．3 精密度試驗 精密移取對照品10．0μL，連續(xù)進(jìn)樣HPLC色譜儀5次，測定峰面積，得異甘草素、甘草苷、甘草酸單銨鹽和甘草次酸峰面積的RSD分別為1．02%、0．96% 、1．05%和1．10%。

2．4 回收率試驗 按1．3．3項制備樣品溶液的方法精密稱取適量的已測知含量的任一樣品5份，制備不同的樣品溶液，分別加入已知量的相應(yīng)的對照品溶液。按照2．3項下的色譜條件測定，計算異甘草素、甘草苷、甘草酸單銨鹽和甘草次酸的回收率，結(jié)果顯示，其平均回收率分別為98．0%、98．8%、98．9%和99．6%。結(jié)果見表4。

表4 加樣回收率試驗結(jié)果 （n＝5）

2．5 穩(wěn)定性試驗 精密吸取同一樣品溶液10．0 μL，分別于0、4、8、12、24h注入 HPLC色譜儀，按照1．3．2項下的色譜條件測定異甘草素、甘草苷、甘草酸單銨鹽和甘草次酸的峰面積。結(jié)果顯示，異甘草素、甘草苷、甘草酸單銨鹽和甘草次酸峰面積的RSD分別為1．02%、1．11%、1．07%、和1．15%，表明樣品在24h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2．6 待檢樣品溶液中甘草主要成分的測定 將1．3．3項下待檢溶液進(jìn)行測定并計算各成分的含量，并將其與生甘草中各主要成分含量分別進(jìn)行方差分析。結(jié)果見表5。

表5 不同配伍甘草中各成分含量測定結(jié)果 （n＝3；±S）

表5 不同配伍甘草中各成分含量測定結(jié)果 （n＝3；±S）

注：同列數(shù)據(jù)肩標(biāo)大寫字母表示差異極顯著（P＜0．01）；－：不能檢出

組別 異甘草素（%） 甘草苷（%） 甘草酸單銨鹽（%） 甘草次酸（%）生甘草 0．025 1±0．000 3 0．410 5±0．004 1 2．098 1±0．022 73．886 2±0．037 8大戟 － － － －大戟甘草 0．024 2A±0．000 2 0．411 2±0．003 9 2．158 1A±0．021 3 2．955 1A±0．028 9海藻 － － － －海藻甘草 0．025 4±0．000 2 0．398 7±0．004 0 2．650 3 A±0．025 7 3．059 7A±0．030 8芫花 － － － －芫花甘草 0．034 9 A±0．000 3 0．401 6±0．003 8 2．240 2 A±0．021 8 1．321 4A±0．012 3甘遂 － － － －甘遂甘草 0．023 8 A±0．000 2 0．385 6 A±0．003 5 2．130 7±0．020 5 2．709 2A ±0．026 7

數(shù)據(jù)用MICROSOFT EXCEL軟件處理，單因素方差分析，并以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，結(jié)果見表4。從表4中可以看出，在同樣的處理條件下，與生甘草相比，大戟與甘草配伍對異甘草素、甘草酸單銨鹽和甘草次酸的含量影響極顯著，甘草酸單銨鹽的含量提高了2．9% ，異甘草素和甘草次酸的含量分別降低了3．6%和24．0%；海藻與甘草配伍對甘草酸單銨鹽和甘草次酸的含量影響極顯著，甘草酸單銨鹽的含量提高了26．3%，甘草次酸的含量降低了21．2%；芫花與甘草配伍對異甘草素、甘草酸單銨鹽和甘草次酸的含量影響極顯著，異甘草素和甘草酸單銨鹽的含量提高了39．0%和6．8%，甘草次酸的含量降低了66．0%；甘遂與甘草配伍對異甘草素、甘草苷和甘草次酸的含量影響極顯著，分別降低了5．2%、6．1%和30．2%，甘草酸單銨鹽影響不顯著。

3 討論

3．1 從藥效方面來看，海藻、大戟、甘遂、芫花均為逐水消腫藥，甘草的主要成分甘草酸水解后產(chǎn)生甘草次酸有類似腎上腺皮質(zhì)激素樣作用，能使水鈉潴留。因此，從體內(nèi)水鹽代謝來看，甘草和這4味藥是相反的，對治療水腫這一指標(biāo)來說應(yīng)忌配伍。黃文權(quán)［3］等試驗動物毒性藥理試驗研究結(jié)果證實了，海藻、大戟、甘遂、芫花和甘草的配伍對大鼠心肝腎有一定的毒副作用。

3．2 從檢測結(jié)果可得出，除甘遂外，大戟、海藻、芫花和甘草配伍均可顯著提高甘草酸的溶出率，結(jié)合3．1可推斷，大戟、海藻、芫花和甘草配伍會加重由甘草酸導(dǎo)致的水鹽代謝失衡等副作用。同時，海藻、大戟、甘遂、芫花同甘草的不同配伍能不同程度的影響甘草中主要藥理活性物質(zhì)的溶出率，這可能與其對機體的毒副作用有一定的相關(guān)性，但此推斷還有待進(jìn)一步研究證實。

［1］ 中華人民共和國藥典委員會．中國藥典（2005年版一部）［M］．北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2005：79－80．

［2］ 樓錦英．“藻戟芫遂俱戰(zhàn)草”之實驗與臨床研究述要［J］．海峽藥學(xué)，2009，21（8）：145－147．

［3］ 黃文權(quán)，羅羽．甘草與甘遂、大戟、海藻、芫花配伍對大鼠心、肝、腎功能的影響［J］．中國臨床康復(fù)，2004，8（18）：3682－3683．

［4］ 李生洪．甘草不良反應(yīng)的研究［J］．時珍國醫(yī)國藥，2007，18（8）：2042．