杜冬華，周 靜，王愛華

（河北北方學(xué)院動物科技學(xué)院動物醫(yī)學(xué)系，河北 張家口075131）

雞減蛋綜合征（EDS－76）是由雞減蛋綜合征病毒引起的，臨床癥狀主要表現(xiàn)為產(chǎn)蛋雞產(chǎn)薄殼蛋或無殼蛋，產(chǎn)蛋率嚴(yán)重下降，是世界范圍內(nèi)危害養(yǎng)雞業(yè)的重要疾病之一。

現(xiàn)已證實(shí)，EDSV基因組由線性雙鏈DNA組成，DNA的分子量為33kb，主要編碼五鄰體、pⅧ、六鄰體、pⅥ、纖維蛋白、DNA結(jié)合蛋白、DNA多聚合酶、100k、末端蛋白、lvaⅡ等結(jié)構(gòu)蛋白。其中，六鄰體蛋白是EDSV的主要結(jié)構(gòu)蛋白，多肽長910個氨基酸，約110kD，它與五鄰體蛋白和纖維蛋白一起構(gòu)成腺病毒的衣殼，并決定病毒粒子的大小，其中含有主要的屬和亞屬特異性抗原決定簇和次要的抗原決定簇，對研制基因工程疫苗具有重要的意義［1－4］。

但目前對EDSV 六鄰體基因的研究局限于對其基因序列的分析，然后推導(dǎo)出氨基酸序列，對六鄰體蛋白的表達(dá)及功能的研究較少。因此，現(xiàn)在對減蛋綜合征病毒詳細(xì)的分子生物學(xué)背景仍不清楚，阻礙了后續(xù)研究進(jìn)展。本試驗(yàn)旨在對雞減蛋綜合征病毒河北分離株進(jìn)行研究，利用大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)，表達(dá)出六鄰體蛋白，探索其用于免疫預(yù)防的可行性，對研制基因工程疫苗有重要意義。

1 材料與方法

1．1 材料 雞抗 EDSV 國際標(biāo)準(zhǔn)株（AV－127）血清，購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；兔抗EDSV－HB株血清由河北北方學(xué)院預(yù)防獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室制備。

重組質(zhì)粒：包含六鄰體（Hexon）基因序列的重組質(zhì)粒pBS－H由本課題組構(gòu)建。

1．2 Hexon基因原核表達(dá)載體構(gòu)建 將含Hexon基因重組質(zhì)粒pBS－H 和原核表達(dá)載體pET－32a－c（＋）用EcoRⅠ和HindⅢ雙酶切，純化后將二者連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP10感受態(tài)細(xì)胞，用EcoRⅠ和HindⅢ雙酶切鑒定，陽性重組質(zhì)粒命名為pET－H。

1．3 目的基因的誘導(dǎo)表達(dá) 將重組質(zhì)粒pET－H轉(zhuǎn)化BL21（DE3），接入含 AMP（200μg／mL）的LB培養(yǎng)基。37℃振蕩培養(yǎng)至OD600＝0．6。從中取1 mL作為對照。剩余樣品加入IPTG至終濃度1 mmol／L，繼續(xù)培養(yǎng)3h。搖瓶冰浴5min，5 000r／min（4℃）離心5min收集菌體，棄上清，加入100 μL 1×SDS上樣緩沖液，100℃煮沸10min 12 000 r／min（4℃）離心5min，取上清液10μL，參考文獻(xiàn)［5］方法，用7．5%的SDS－PAGE、Western－blotting檢測表達(dá)產(chǎn)物。

1．4 重組蛋白的大量表達(dá) 挑取重組菌單菌落接種于10mL氨芐青霉素／LB培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)過夜，接入2 000mL Amp／LB液體培養(yǎng)基，按上述方法誘導(dǎo)表達(dá)。參考文獻(xiàn)［9］方法，測定蛋白溶解性，純化表達(dá)蛋白。

1．5 重組蛋白動物免疫試驗(yàn) 取6只6周齡雞，初次免疫將重組蛋白與福氏完全佐劑按1∶1的比例混合乳化，胸肌多點(diǎn)注射，100μg／只。2免和3免，將重組蛋白與不完全福氏佐劑按1∶1比例混合、乳化，加強(qiáng)免疫兩次，150μg／只，每次免疫間隔10d。3免后15d采集血樣并分離血清，用間接ELISA方法檢測免疫雞抗體水平。

2 試驗(yàn)結(jié)果

2．1 重組質(zhì)粒pET－H雙酶切鑒定 重組質(zhì)粒pET－H用EcoRⅠ和HindⅢ進(jìn)行雙酶切鑒定，結(jié)果出現(xiàn)兩個條帶，其大小分別為2．7kb及5．9kb。表明Hexon基因已正確連接到pET－32a－c（＋）表達(dá)載體（見圖1）。

2．2 目的蛋白的表達(dá) 重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化BL21表達(dá)菌株經(jīng)誘導(dǎo)后，用SDS－PAGE方法分析，出現(xiàn)一條約110kDa的條帶，與預(yù)期結(jié)果相符，而未經(jīng)誘導(dǎo)菌株及空載體pET－32a的對照菌則未出現(xiàn)這一條帶，如圖2所示。

2．3 Western－blotting鑒定重組蛋白 將目的蛋白和空載體表達(dá)產(chǎn)物裂解后進(jìn)行SDS－PAGE，再轉(zhuǎn)移到醋酸纖維膜上，兔抗EDSV－HB株血清作為一抗與之特異性結(jié)合，再經(jīng)HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG顯色，出現(xiàn)一條特異性抗原抗體結(jié)合帶，而空載體沒有，從而證明表達(dá)的目的蛋白是Hexon蛋白，結(jié)果如圖3。

2．4 免疫雞抗重組蛋白血清效價的檢測 將純化后的六鄰體蛋白以最佳包被濃度（1∶200，15μg／mL）包被96孔酶標(biāo)反應(yīng)板，按文獻(xiàn)［9］方法測定免疫雞的抗體效價，設(shè)陰性對照組，結(jié)果見表3。

陰性血清 OD490平均值為0．082，標(biāo)準(zhǔn)差為0．014，陰陽性臨界值為＝0．082＋ 3×0．014＝0．124，即陽性受檢血清抗體效價為OD490值高于0．124的最高血清稀釋倍數(shù)。

由表3可以看出，在免疫雞中，產(chǎn)生抗六鄰體蛋白的抗體效價最高達(dá)1∶12 800，且多數(shù)免疫雞抗體效價均在1∶6 400以上。表明體外表達(dá)的重組六鄰體蛋白能夠保留天然蛋白所具有的免疫原性。

表3 六鄰體蛋白免疫雞后ELISA抗體效價

3 討論

3．1 本試驗(yàn)用pET－32a－c（＋）原核表達(dá)載體對雞減蛋綜合征病毒河北分離株六鄰體蛋白進(jìn)行了優(yōu)化表達(dá)。表達(dá)的重組蛋白分子量約110kDa，經(jīng)SDSPAGE電泳分析，分子量與預(yù)期一致。之后，用Western－blotting方法檢測重組蛋白，用兔抗EDSV河北分離株陽性血清作為一抗與之進(jìn)行特異性結(jié)合，再經(jīng)HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗顯色，出現(xiàn)一條特異性的抗原抗體結(jié)合帶，而空載體則沒有，從而證明表達(dá)的目的蛋白是六鄰體蛋白，同時也可表明該重組蛋白具有免疫原性。

3．2 本試驗(yàn)旨在探索用重組的六鄰體蛋白預(yù)防雞減蛋綜合征的可行性，純化的重組六鄰體蛋白免疫6周齡試驗(yàn)雞后，3免后用間接ELISA方法檢測血清抗體水平。結(jié)果表明，本試驗(yàn)得到的重組六鄰體蛋白能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生高水平抗體，充分證明重組的六鄰體蛋白具有很好的免疫原性，為研制減蛋綜合征基因工程疫苗打下良好的基礎(chǔ)，但其生產(chǎn)成本、免疫劑量及免疫佐劑等方面的問題都有待進(jìn)一步的解決。

［1］ 肖妙，工君偉．減蛋綜合癥病毒五鄰體重組蛋自的原核表達(dá)及抗原性鑒定［J］．東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2009，40（2）：83－87．

［2］ 吳國平．雞減蛋綜合征病毒分子生物學(xué)研究近況［J］．中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報，2002，22（2）：156－158．

［3］ 張春杰，張敏，吳庭才，等．EDSV六鄰體蛋白基因克隆與原核表達(dá)載體構(gòu)建［J］．河南科技大學(xué)學(xué)報，2005，4（26）：80－82．

［4］ 羅君毅，蓋偉偉，雷磊，等．SARS－CoV S蛋白的原核表達(dá)及其黏膜免疫效應(yīng)［J］．武漢大學(xué)學(xué)報，2006，6（52）：733－738．

［5］ J．薩姆布魯克，D．W．拉塞爾著，黃培堂，等譯．分子克隆實(shí)驗(yàn)指南［M］．第三版．北京：科學(xué)出版社，2002：96－98．