雷永紅，陳利平，王發(fā)渭，孫志高，許成勇

隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展、人們生活水平的提高、生活方式的改變，以及人口老齡化進(jìn)程的加劇，缺血性腦血管病的發(fā)生率不斷升高。有關(guān)對(duì)缺血性腦血管病導(dǎo)致的學(xué)習(xí)、記憶損害的保護(hù)作用及其神經(jīng)生物學(xué)機(jī)制研究一直是神經(jīng)科學(xué)的研究熱點(diǎn)[1]。缺血性腦血管病為中老年人常見病、多發(fā)病，嚴(yán)重威脅人類生命健康，致殘率高，病理機(jī)制復(fù)雜[2]。

目前研究認(rèn)為，缺血性神經(jīng)元損傷的病理較為復(fù)雜，主要過程包括神經(jīng)細(xì)胞的自身?yè)p傷機(jī)制和腦缺血性損傷級(jí)聯(lián)反應(yīng)[3]。缺血性腦血管病是由各種原因引起的慢性腦血流減少，促使腦組織發(fā)生病理及生化改變，引起能量代謝障礙、葡萄糖利用減少、蛋白質(zhì)合成異常、神經(jīng)遞質(zhì)改變、膽堿受體缺失、腦白質(zhì)損害和神經(jīng)元缺失等，這些構(gòu)成了慢性腦缺血導(dǎo)致功能障礙的病理生理學(xué)基礎(chǔ)[4]。

神經(jīng)肽(neuropeptide Y,NPY)是一種生物活性多肽，作為神經(jīng)遞質(zhì)廣泛分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，其作用與學(xué)習(xí)、記憶、驚厥、疼痛、焦慮、抑郁、攝食等有關(guān)[5]。由于缺血性腦血管病的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，目前臨床大多從某一環(huán)節(jié)或某一途徑治療，采用膽堿酶抑制劑、腦循環(huán)改善劑、鈣離子拮抗劑、興奮性氨基酸受體拮抗劑等。近年來，越來越多的學(xué)者將目光轉(zhuǎn)向中醫(yī)藥。中醫(yī)藥對(duì)缺血性腦血管病的治療有著獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)和較好的療效[6]。既往研究報(bào)道，參龍湯具有補(bǔ)腎益氣活血的作用，能提高腦缺血大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，增強(qiáng)腦缺血大鼠腦海馬區(qū)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子表達(dá)[7]。本研究采用慢性腦缺血?jiǎng)游锬Ｐ?，觀察參龍湯對(duì)腦缺血大鼠學(xué)習(xí)記憶能力以及對(duì)血漿NPY水平和海馬NPY表達(dá)的影響，為臨床治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)Wistar大鼠，鼠齡3個(gè)月，體重180~220 g，雌雄各半，由解放軍總醫(yī)院醫(yī)學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，許可證編號(hào)：SCXK(京)2009-0015。

1.2 藥品、試劑及實(shí)驗(yàn)儀器

1.2.1 藥品 ①參龍湯：解放軍總醫(yī)院中醫(yī)科提供處方，制劑室制備；②吡拉西坦：石家莊中諾藥業(yè)有限公司，批號(hào)：09075103。

1.2.2 試劑 NPY放射免疫試劑盒：由解放軍總醫(yī)院東亞免疫技術(shù)研究所生產(chǎn)；NPY多克隆抗體：北京博奧森生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：990901W；二抗顯色試劑盒：EnVision Detection Kit基因科技(上海)有限公司，批號(hào)：No.GK500705。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)儀器 ①全自動(dòng)真空脫水機(jī)(LEICA ASP300)、組織包埋機(jī)(LEICA EG1140H)、石蠟切片機(jī)(LEICA RM2135)、展片機(jī)(LEICA HI1210)：德國(guó)LEICA公司；②光學(xué)顯微鏡：日本Olympus BX60系統(tǒng)顯微鏡；③酶標(biāo)儀：THERMO MultiskanMK3(美國(guó))。

1.3 模型制備與分組

根據(jù)文獻(xiàn)[8]制備慢性腦缺血再灌注模型。大鼠禁食12 h，禁水6 h，10%水合氯醛(30 mg/100g)腹腔麻醉，備皮消毒、剪開頸部皮膚，找到雙側(cè)頸總動(dòng)脈，0號(hào)絲線結(jié)扎。傷口撒頭孢唑啉鈉粉末0.25 g后逐層縫合，放回籠中飼養(yǎng)。假手術(shù)組僅分離頸總動(dòng)脈，不做任何處理。造模后大鼠分為：假手術(shù)組，模型組，參龍湯小劑量組、大劑量組，吡拉西坦組，每組大鼠10只。

排除有明顯肢體障礙大鼠，最后納入統(tǒng)計(jì)：假手術(shù)組10只，模型組8只，參龍湯大劑量組8只、小劑量組9只，吡拉西坦組8只。

術(shù)后3 d開始給藥，參照陳奇方法[9]給藥，根據(jù)參龍湯和吡拉西坦的臨床口服量，按體重?fù)Q算出大鼠對(duì)應(yīng)于人的等效量，確定小劑量組、大劑量組和吡拉西坦組分別含生藥80 g/L、240 g/L、90 g/L。大鼠灌胃量為1 ml/d，假手術(shù)組、模型組生理鹽水灌胃，連續(xù)28 d。

1.4 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)

給藥28 d后進(jìn)行水迷宮實(shí)驗(yàn)。在暗室中放置一直徑1.3 m、深0.5 m圓形水池，池壁為黑色，標(biāo)明A、B、C、D四個(gè)象限，在任一象限放置一個(gè)直徑10 cm，高30 cm安全平臺(tái)，水面沒過平臺(tái)約2 cm，水中注入適量墨汁，以目視看不到平臺(tái)為宜，水溫控制在26℃左右；大鼠訓(xùn)練2 d，開始實(shí)驗(yàn)5 d，記錄大鼠尋找到安全平臺(tái)時(shí)間，即逃避潛伏期時(shí)間作為學(xué)習(xí)成績(jī)；第6天撤去平臺(tái)，選第二象限入水點(diǎn)將大鼠面向池壁放入水中，記錄90 s內(nèi)大鼠跨越原平臺(tái)次數(shù)，作為大鼠記憶成績(jī)。

1.5 血清NPY含量測(cè)定及免疫組化

水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，10%水合氯醛(30 mg/100 g)腹腔注射麻醉取血，血液在冰浴試管中靜置30 min，4℃、3000 r/min離心10 min，分離血清，保存在-70℃冰箱中，按說明進(jìn)行NPY含量測(cè)定。大鼠腹腔注射麻醉取血后斷頭取腦，參照大鼠腦立體定位圖譜[10]，取海馬組織，脫水、包埋，置于APES防脫玻片上。60℃烤片4 h，常規(guī)脫蠟、脫水、浸洗；3%H2O210 min，PBS浸洗2 min，共3次；浸入0.01 mol/L檸檬酸鹽緩沖液。微波熱修復(fù)后，滴加一抗NPY多克隆抗體(1∶200)，假手術(shù)組加0.01 mol/L PBS代替一抗，4℃冰箱孵育過夜，室溫復(fù)溫30 min后PBS浸洗5 min，共3次后滴加非生物素二抗，濕盒中室溫30 min，PBS浸洗5 min，共3次，DAB顯色，光鏡下控制時(shí)間，脫水、透明、封片。采用Image Pro plus 5.1圖像分析系統(tǒng)測(cè)定每張照片的陽(yáng)性細(xì)胞。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 學(xué)習(xí)記憶能力

與假手術(shù)組相比，模型組大鼠的逃避潛伏期時(shí)間明顯延長(zhǎng)，跨越平臺(tái)次數(shù)明顯減少(P<0.01)。與模型組相比，參龍湯大劑量組大鼠的逃避潛伏期時(shí)間縮短，跨越平臺(tái)次數(shù)增加(P<0.05)；而吡拉西坦組僅穿越平臺(tái)次數(shù)增加(P<0.05)。見表1。

表1 治療后各組大鼠水迷宮學(xué)習(xí)記憶能力結(jié)果

2.2 血漿NPY含量

與假手術(shù)組相比，模型組大鼠血漿NPY含量明顯升高(P<0.01)。與模型組相比，治療后參龍湯大劑量組和吡拉西坦組大鼠血漿NPY含量減低(P<0.05)。見表2。

2.3 海馬NPY陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)

海馬區(qū)NPY免疫組化蛋白陽(yáng)性表達(dá)呈黃色或棕黃色染色、深淺不一，主要位于細(xì)胞質(zhì)中，胞核不染色。模型組大鼠海馬區(qū)NPY陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯高于假手術(shù)組(P<0.01)；與模型組相比，治療后參龍湯大劑量組和吡拉西坦組大鼠海馬區(qū)NPY陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)減低(P<0.05)。見表2。

表2 治療后各組大鼠血漿NPY含量和海馬NPY陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)

3 討論

缺血性腦血管病導(dǎo)致神經(jīng)功能損傷的重要機(jī)制之一是缺血后引起的腦組織神經(jīng)元損傷[11]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型組大鼠逃避潛伏期時(shí)間較假手術(shù)組明顯延長(zhǎng)，跨越平臺(tái)次數(shù)明顯減少，說明造模成功。參龍湯治療后，腦缺血大鼠逃避潛伏期時(shí)間較模型組縮短，跨越平臺(tái)次數(shù)增加，說明參龍湯可以改善腦缺血大鼠學(xué)習(xí)記憶的能力。

海馬是大腦邊緣系統(tǒng)的重要組成部分，海馬中的遞質(zhì)包括單胺類神經(jīng)遞質(zhì)、膽堿能神經(jīng)遞質(zhì)和氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)，其合成過程和含量變化都與學(xué)習(xí)記憶有關(guān)。各種神經(jīng)遞質(zhì)參與情緒、學(xué)習(xí)、記憶、行為、免疫調(diào)節(jié)等，在學(xué)習(xí)和記憶功能以及調(diào)節(jié)神經(jīng)內(nèi)分泌和自主神經(jīng)活動(dòng)中起著重要作用，是參與調(diào)節(jié)情感、認(rèn)知行為重要的邊緣系統(tǒng)結(jié)構(gòu)[12]。

NPY是生物活性多肽的一種神經(jīng)遞質(zhì)，廣泛分布于中樞及周圍神經(jīng)組織、心血管系統(tǒng)等部位，在人腦中主要分布于基底節(jié)邊緣系統(tǒng)、杏仁核區(qū)、海馬回區(qū)、下丘腦及感覺運(yùn)動(dòng)皮質(zhì)的運(yùn)動(dòng)區(qū)等部位[13]。NPY除參與機(jī)體眾多生理功能的調(diào)節(jié)過程外，還與許多腦血管系統(tǒng)疾病的病理過程有密切關(guān)系。它除自身具有縮血管作用之外，還能通過加強(qiáng)去甲腎上腺素和5-羥色胺的縮血管效應(yīng)，導(dǎo)致血管的痙攣。研究顯示，機(jī)體在應(yīng)激等狀態(tài)下，NPY水平顯著升高，且與擴(kuò)血管物質(zhì)的表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)，提示NPY可以通過抑制舒血管物質(zhì)的分泌達(dá)到抑制血管舒張的作用。

腦缺血缺氧后，反射性地興奮交感-兒茶酚胺系統(tǒng)，使交感神經(jīng)末梢釋放的NPY與腎上腺素增加，加劇腦部血管的收縮，增加神經(jīng)元的缺血缺氧損傷程度[14]。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示，與假手術(shù)組相比，模型組大鼠血漿NPY的含量明顯升高，腦組織海馬區(qū)NPY表達(dá)明顯增加；與模型組相比，參龍湯大劑量組和吡拉西坦組大鼠血漿NPY的含量降低，海馬區(qū)NPY表達(dá)減少，提示參龍湯能降低腦缺血大鼠血漿NPY的含量，減少海馬NPY的表達(dá)，通過調(diào)節(jié)腦血管的舒縮狀態(tài)發(fā)揮其對(duì)腦缺血大鼠海馬神經(jīng)元缺血損傷的保護(hù)作用。

缺血性腦血管病的發(fā)生伴隨年齡的增長(zhǎng)而逐年增加。中醫(yī)認(rèn)為，缺血性腦血管病的發(fā)生與脾腎虧虛、氣虛血瘀痰阻有關(guān)。參龍湯是由本科研制的治療缺血性腦血管病的有效方劑，由生曬參、制首烏、淫羊藿、干地龍、石菖蒲、川芎、遠(yuǎn)志等藥物組成。其中人參大補(bǔ)元?dú)狻采褚嬷?，為君藥。臣藥制首烏補(bǔ)血養(yǎng)肝、益精固髓；淫羊藿溫腎壯陽(yáng)，兩者配伍針對(duì)腎精不足的基本病機(jī)。佐以地龍、川芎活血行氣通絡(luò)，去除腦絡(luò)之瘀阻。石菖蒲、遠(yuǎn)志開竅寧心安神。全方共奏補(bǔ)腎填精、益氣活血、安神增智的功效。前期臨床研究證實(shí)，參龍湯對(duì)于腦缺血及血管性癡呆具有較好的療效[15-17]。

綜上所述，參龍湯可以改善腦缺血大鼠學(xué)習(xí)記憶能力。其作用機(jī)理之一可能為：參龍湯能降低腦缺血大鼠血漿NPY的含量，減少海馬NPY的表達(dá)，通過調(diào)節(jié)腦血管的舒縮狀態(tài)發(fā)揮其對(duì)腦缺血大鼠海馬神經(jīng)元缺血損傷的保護(hù)作用，其作用與劑量有關(guān)。

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