王文娟，武曉寧，賈玉潔，谷 成，閔連秋△

（1.遼寧醫(yī)學(xué)院研究生學(xué)院，遼寧錦州 121000；2.遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，遼寧錦州 121001）

近些年來，糖尿病合并腦梗死的發(fā)病率逐年升高，給人們的健康帶來了嚴重的威脅。糖尿病已經(jīng)被認為是腦梗死的獨立危險因素，能加重神經(jīng)細胞的凋亡，增加了腦梗死的致殘率和病死率，嚴重地影響了患者預(yù)后的生活質(zhì)量。有關(guān)糖尿病加重腦梗死的機制近年來研究較多，但具體機制至今尚未明確［1］。本實驗旨在探討大鼠局灶性腦缺血早期Ras／Raf／絲裂原激活蛋白激酶（mitogenactivatedp rotein kinase kinase，MEK）／細胞外信號調(diào)節(jié)激酶（extracellular signal－regulated kinase，ERK）信號傳導(dǎo)通路的作用，以及糖尿病加重腦梗死與Ras／Raf／MEK／ERK傳導(dǎo)通路的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料 選取健康的雄性SD大鼠，體質(zhì)量280～330g，由遼寧醫(yī)學(xué)院動物實驗中心提供，合格證號［SCXK（遼）2003－0007］。PD98059 由 德 國 默 克 公 司 提 供 （批 號 51300I）；p－ERK1／2一抗、二抗均由北京博奧森生物有限公司提供，末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶接到的dUTP原位切口末端標記（TUNEL）試劑盒購于南京凱基公司。

1.2 方法

1.2.1 2型糖尿?。═2DM）大鼠腦缺血模型的建立 取SD大鼠常規(guī)飼料適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，然后喂飼高脂高糖飼料（10%豬油，2.5%膽固醇，1.0%豬膽酸鹽，20.0%糖，66.5%常規(guī)飼料［2］）。4周后，按25.0mg／kg［3］體質(zhì)量的劑量一次性尾靜脈注射鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ）溶液。72h后取尾血測血糖，血糖超過16.7mg／kg為T2DM大鼠［4］。選取T2DM造模成功的SD大鼠，按照文獻［5］制作大鼠大腦中動脈缺血模型（middle cerebral artery occlusion，MCAO）。麻醉后的SD大鼠頸部正中切口，暴露并鈍性游離左側(cè)頸總動脈（common carotid artery，CCA），結(jié)扎同側(cè)CCA近心端和頸外動脈（external carotid artery，ECA）分叉部，距CCA末端約5mm處剪口，選用頭端燒成光滑杵狀的國產(chǎn)尼龍線（直徑0.235mm，長6 cm）插入，以頸總動脈分叉處計算進線深度為（18.0±0.5）mm，至大腦中動脈起始部以完全阻斷血供。假手術(shù)組手術(shù)步驟同上，但不插入線栓。

1.2.2 分組與給藥 將大鼠分為假手術(shù)組、健康大鼠腦缺血組、T2DM大鼠腦缺血組、PD98059組，每組12只。假手術(shù)組是選取健康大鼠只游離出動脈不進行栓塞；健康大鼠腦缺血組是選取血糖正常，進行MCAO造模成功的大鼠；T2DM腦缺血組為選取糖尿病造模成功且MCAO造模成功大鼠；PD98059組為選取糖尿病造模成功且MCAO造模成功大鼠，此組大鼠于 MCAO術(shù)前30min尾靜脈注射 PD98059（3mL／kg）。MCAO術(shù)2h后各組取6只大鼠麻醉、處死、灌流、石蠟包埋固定制成病理切片；每組剩余的6只大鼠迅速取缺血側(cè)大腦海馬，保存于－80℃冰箱。

1.2.3 評價標準 參照Bederson 6級5分評分標準，對大鼠MCAO術(shù)后2h進行3次神經(jīng)功能評分，平均值大于或等于2分提示造模成功，評分標準見表1。

表1 Bederson評分標準

1.2.4 檢測方法

1.2.4.1 TUNEL法檢測大鼠腦組織神經(jīng)細胞凋亡 切片常規(guī)脫蠟水化，3%H2O2室溫處理后蛋白酶K于37℃消化10 min，標記液32℃標記2h，后封閉30min，生物素化地高辛抗體37℃反應(yīng)37min。加SABC、DAB顯色，常規(guī)封片。在海馬CA3區(qū)不重復(fù)隨機選取5個高倍視野，在400倍光鏡下計算陽性細胞（陽性細胞數(shù)／計數(shù)細胞總數(shù)）100% 。

1.2.4.2 免疫組化法檢測大鼠腦組織p－ERK1／2的表達 采用SABC法按照免疫組化試劑盒說明進行。顯微鏡下觀察缺血側(cè)大腦海馬CA3區(qū)p－ERK1／2表達情況，每張免疫組化切片中采集5個具有代表性的高倍視野，在400倍光鏡下計數(shù)海馬CA3區(qū)p－ERK1／2的陽性細胞數(shù)。

1.2.4.3 蛋白質(zhì)印跡法（Western blotting）檢測大鼠腦組織p－ERK1／2的表達 將凍存的腦組織剪碎置于裂解液中機械勻漿，4℃17 000r／min離心1h，取出上清液。用考馬斯亮藍G250結(jié)合法，根據(jù)已知牛血清清蛋白溶液的濃度及其吸光度和樣品吸光度計算樣品蛋白濃度和加樣量。加入樣品緩沖液，置于沸水浴中5min使蛋白變性。制備7.5%分離膠和4%濃縮膠，將樣品加在凝膠表面的樣品槽中，電泳后轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上。5%奶粉TTBS緩沖液振蕩封閉3h后洗膜，分別加入一抗、β－actin，4℃冰箱孵育1夜。洗膜，辣根酶標記，室溫孵育1h，洗膜后進行增強化學(xué)發(fā)光（enhanced chemilum inescence，ECL）反應(yīng)1～3min，暗室曝光，顯影后沖洗膠片。凝膠成像分析系統(tǒng)攝像分析測定目標帶的光密度（integrated density value，DV），計算出各指標各組目標帶與β－actin DV比值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件進行分析，計量資料以±s表示。組間顯著性檢驗采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 大鼠神經(jīng)行為學(xué)評分 T2DM大鼠腦缺血組較健康大鼠腦缺血組神經(jīng)行為學(xué)評分明顯增高，而PD98059組神經(jīng)行為學(xué)評分明顯降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），見表2。

表2 大鼠神經(jīng)行為學(xué)評分

2.2 免疫組織化學(xué)測定大鼠缺血側(cè)大腦海馬CA3區(qū)p－ERK1／2蛋白的表達 p－ERK1／2陽性染色呈深棕色，常存在于神經(jīng)元胞漿中，磷酸化后轉(zhuǎn)移至細胞核。陽性染色的神經(jīng)細胞核呈深棕色，多數(shù)發(fā)生形態(tài)學(xué)改變，胞核皺縮，核仁偏位或者缺失。假手術(shù)組偶見p－ERK1／2陽性蛋白表達。健康大鼠腦缺血組可見p－ERK1／2陽性神經(jīng)細胞核，T2DM大鼠腦缺血組陽性胞核增多，PD98059組陽性胞核明顯減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），見表3、圖1。

2.3 Western blotting測定大鼠缺血側(cè)海馬p－ERK1／2蛋白

p－ERK1／2蛋白在假手術(shù)組表達較少，在健康大鼠腦缺血組和T2DM大鼠腦缺血組表達較多，且T2DM大鼠腦缺血組增高明顯P＜0.01，而p－ERK1／2蛋白在PD98059組表達明顯減少，見表4、圖2。

2.4 TUNEL法檢測大鼠缺血側(cè)大腦海馬CA3區(qū)神經(jīng)細胞凋亡情況 凋亡的神經(jīng)細胞核為棕黃色顆粒。假手術(shù)組海馬CA3區(qū)偶見神經(jīng)細胞凋亡，健康大鼠腦缺血組缺血側(cè)海馬CA3區(qū)見較多神經(jīng)細胞凋亡，T2DM大鼠腦缺血組凋亡率較健康大鼠腦缺血組明顯升高（P＜0.01），而PD98059組凋亡率明顯下降，見表5。

表3 免疫組織化學(xué)測定大鼠缺血側(cè)大腦海馬CA3區(qū)p－ERK1／2陽性細胞數(shù)

圖1 免疫組織化學(xué)測定大鼠缺血側(cè)大腦海馬CA3區(qū)p－ERK1／2陽性表達（×400）

表4 Western－blotting法檢測大鼠缺血側(cè)海馬p－ERK1／2蛋白灰度比值（±s）

表4 Western－blotting法檢測大鼠缺血側(cè)海馬p－ERK1／2蛋白灰度比值（±s）

＊：P＜0.01，與假手術(shù)組比較；＃：P＜0.01，與健康大鼠腦缺血比較。

組別 n 6 0.003 2±0.000 1健康大鼠腦缺血組 6 0.012 4±0.000 2＊T2DM大鼠腦缺血組 6 0.038 4±0.001 7＊＃PD98059組 6 0.007 4±0.000 1＊?；叶缺戎导偈中g(shù)組

圖2 Western blotting法檢測大鼠缺血側(cè)海馬p－ERK1／2蛋白的表達

表5 大鼠缺血側(cè)大腦海馬CA3區(qū)神經(jīng)細胞凋亡率

3 討 論

腦缺血后神經(jīng)細胞的凋亡是一個動態(tài)進行的過程，在早期（30min時）缺血區(qū)會出現(xiàn)明顯的水腫，水腫區(qū)的周圍出現(xiàn)少量的凋亡細胞，隨著缺血時間的延長神經(jīng)細胞的凋亡數(shù)目增加，凋亡的神經(jīng)細胞主要位于缺血半暗帶區(qū)，而缺血中心區(qū)細胞的死亡以壞死為主［6］，因此選取大鼠海馬CA3區(qū)作為觀察區(qū)域。本實驗主要研究大鼠腦缺血早期神經(jīng)細胞的凋亡情況及與Ras／Raf／MEK／ERK信號傳導(dǎo)通路的關(guān)系，所以選取MCAO術(shù)后2h作為觀察的時間點。

Ras／Raf／MEK／ERK信號傳導(dǎo)通路是一條可以被多種因素廣泛激活的有絲分裂原活化蛋白激酶（mitogen－activated protein kinase，MAPK）通路。MAPK通路的核心包括3種蛋白激酶：（1）MAPKKK，是一類絲／蘇氨酸蛋白激酶，Raf為其中重要的一員；（2）MAPKK，具有磷酸化蘇／酪氨酸殘基的雙特異功能，Mek為其中重要的一員；（3）MAPK是一類絲／蘇氨酸蛋白激酶，Erk即為其中重要的一員［7］。是當(dāng)Ras受到細胞外信號刺激時，即轉(zhuǎn)化為激活型Ras，激活型Ras繼而激活Raf－1；而Raf－1可將 MEK磷酸化激活，p－MEK進一步磷酸化ERK1／2，然后p－ERK1／2再將細胞核內(nèi)的 ElK－1L磷酸化，此瀑布式的激活過程將神經(jīng)細胞外的信號通過細胞膜、細胞質(zhì)傳遞到細胞核，來調(diào)節(jié)細胞周期調(diào)控細胞的增殖、分化和凋亡等生理病理過程［8］。PD98059是ERK的上游激酶 MEK－1特異性阻斷劑，能夠阻斷Ras／Raf／MEK／ERK信號通路的傳導(dǎo)，從而影響了細胞的命運。本實驗采用TUNEL染色法，對比觀察高血糖、高血脂大鼠和健康大鼠MCAO術(shù)后2h海馬CA3區(qū)神經(jīng)細胞凋亡變化，并通過免疫組織化學(xué)、Western blotting，對比觀察高血糖、高血脂大鼠和健康大鼠p－ERK1／2蛋白表達變化，以明確Ras／Raf／MEK／ERK信號傳導(dǎo)通路是否參與了T2DM加重腦缺血損傷時的神經(jīng)細胞凋亡，從而進一步明確高血糖、高血脂加重腦缺血損傷的機制。從實驗結(jié)果看，與健康大鼠腦缺血組相比，T2DM大鼠腦缺血組的p－ERK1／2蛋白表達明顯增加（P＜0.01），免疫組織化學(xué)與 Western blotting結(jié)果一致。TUNEL結(jié)果顯示，健康大鼠腦缺血組有部分神經(jīng)細胞凋亡，而T2DM大鼠腦缺血組凋亡率明顯升高（P＜0.01），可見高血糖、高血脂能引起P－ERK1／2蛋白上調(diào)從而加重了神經(jīng)細胞的凋亡。

可以推論 Ras／Raf／MEK／ERK信號傳導(dǎo)通路可能是T2DM加重缺血性腦損傷機制中的一條重要的信號傳導(dǎo)通路。但從實驗結(jié)果看，阻斷了Ras／Raf／MEK／ERK信號傳導(dǎo)通路僅能部分抑制神經(jīng)細胞的凋亡，經(jīng)PD98059干預(yù)的缺血組其神經(jīng)細胞的凋亡率仍明顯高于假手術(shù)組（P＜0.01），這與付度關(guān)［9］得出的結(jié)論一致，這又進一步說明了神經(jīng)細胞凋亡機制的復(fù)雜性，需要更進一步的研究。

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