汪 洋，檀華蓉，周冠宇，王希春，吳金節(jié)＊

（1.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，安徽合肥230036；2.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)生物技術(shù)中心，安徽合肥230036）

中藥復(fù)方透皮貼劑（專利號(hào)：ZL 2010 1 0132973.2）為治療奶牛乳房炎的純中藥制劑，含有黃連、馬蘭、木芙蓉、黃芩、紫花地丁等成分，具有清熱解毒、行氣活血散瘀等功效［1］。黃連的主要成分為鹽酸小蘗堿［2］，黃芩的主要成分為黃芩苷［3］，木芙蓉中含有蘆丁［4］，馬蘭、紫花地丁均含有黃酮類成分［5－6］。為了確定該復(fù)方中有效成分的含量，本試驗(yàn)建立了測(cè)定其中3種不同主要有效成分鹽酸小蘗堿、黃芩苷、蘆丁的高效液相色譜（high efficiency liquid chromatography，HPLC）方法，為制定該中藥制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器設(shè)備 Waters高效液相色譜儀（600泵，2998紫外檢測(cè)器）為美國(guó)Waters公司產(chǎn)品；Sartorius 1712電子分析天平為德國(guó)Sartorius公司產(chǎn)品；KQ－400KDE 超聲波清洗器為昆山市超聲儀器有限公司產(chǎn)品；RE－5203旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀為上海亞榮生化儀器有限公司產(chǎn)品；索氏提取器。

1.1.2 試劑 黃連、馬蘭、木芙蓉、黃芩、紫花地丁等均購(gòu)于亳州濟(jì)人藥業(yè)有限公司；鹽酸小蘗堿和黃芩苷對(duì)照品購(gòu)于中國(guó)藥品檢驗(yàn)所（批號(hào)分別為A0151－20mg，A0016－20mg）；蘆丁購(gòu)于中國(guó)藥品生物制品鑒定所（批號(hào)100080－200707）；乙腈、冰醋酸為色譜純（TEDIA）；水為娃哈哈純凈水。

1.2 方法

1.2.1 色 譜 條 件 色 譜 柱：PhenomenexC18（4.6mm×150mm，5μm）。流動(dòng)相：乙腈（B）－10mL／L冰醋酸（C）。洗脫方式：梯度洗脫（0→25min，B 20%→40%，C 80%→60%；25min→30min，B 40%→20%，C 60%→80%）。流速：1.0mL／min。檢測(cè)波長(zhǎng)：265nm。柱溫：30℃。

1.2.2 溶液制備

1.2.2.1 對(duì)照品溶液制備 精密稱取鹽酸小蘗堿、蘆丁對(duì)照品各10mg以及黃芩苷5mg，置于10mL量瓶中，用800mL／L甲醇溶解定容至刻度，即得3種對(duì)照品儲(chǔ)備液。

1.2.2.2 供試品溶液制備 精密稱取復(fù)方中所有中藥材（粉碎后）1.8g置于平底燒瓶，用藥材6倍量的600mL／L乙醇回流提取3次，每次3h。醇提液經(jīng)3 000r／min離心后取上清液保存為藥液Ⅰ。藥渣再用水煎煮提取，提取2次，每次8倍量水，每次1h。水煎液經(jīng)離心除雜后得藥液Ⅱ。合并藥液Ⅰ和藥液Ⅱ旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，加入800mL／L甲醇定容至25mL。

1.2.3 線性關(guān)系考察 分別吸取上述3種對(duì)照品儲(chǔ)備液，用800mL／L甲醇稀釋成100μg／mL（鹽酸小蘗堿、蘆?。┖?0μg／mL（黃芩苷）的混合溶液。再將此混合溶液等比稀釋成6個(gè)不同濃度，分別進(jìn)樣10μL，測(cè)定峰面積。以濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并進(jìn)行回歸分析。

1.2.4 精密度試驗(yàn) 取同一份混合對(duì)照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，每次10μL。分別計(jì)算鹽酸小蘗堿、蘆丁和黃芩苷含量的RSD值。

1.2.5 重現(xiàn)性試驗(yàn) 取同一批藥材，分別照1.2.2.2供試品溶液制備方法提取得6份供試品溶液，照擬定的樣品含量測(cè)定方法操作測(cè)得峰面積，分別計(jì)算鹽酸小蘗堿、蘆丁和黃芩苷的RSD值。

1.2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液，分別于提取后0、2、4、6、8、10h進(jìn)樣。照擬定的樣品含量測(cè)定方法操作測(cè)得峰面積，分別計(jì)算鹽酸小蘗堿、蘆丁和黃芩苷的RSD值。

1.2.7 回收率試驗(yàn) 精密稱取已知含量的復(fù)方中藥9份，分別精密加入高、中、低3個(gè)不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品3份，按1.2.2.2供試品溶液制備方法操作。照擬定的樣品含量測(cè)定方法操作測(cè)得峰面積，計(jì)算鹽酸小蘗堿、蘆丁和黃芩苷的平均加樣回收率。

1.2.8 樣品測(cè)定 精密稱取3份同一批次中藥材，按供試品溶液方法提取后以既定含量測(cè)定方法操作，進(jìn)樣10μL。對(duì)色譜圖進(jìn)行分析，計(jì)算樣品中鹽酸小蘗堿、黃芩苷和蘆丁的含量。

2 結(jié)果

2.1 對(duì)照品溶液色譜圖

在1.2.1條件下色譜圖見圖1。鹽酸小蘗堿、黃芩苷和蘆丁分別在8、15、18min時(shí)出峰，分離效果良好。

圖1 鹽酸小蘗堿、黃芩苷、蘆丁高效液相色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram of berberine hydrochloride，baicalin and rutin

2.2 線性關(guān)系考察結(jié)果

以濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并進(jìn)行回歸分析后得到回歸方程。鹽酸小蘗堿：Y＝17 455X＋2 959.2，R2＝1；黃芩苷：Y＝78 251X－34 125，R2＝0.9 999；蘆丁：Y＝12 912X＋7 513.9，R2＝0.999 8。

2.3 精密度試驗(yàn)結(jié)果

經(jīng)計(jì)算得到鹽酸小蘗堿RSD值為1.07%，黃芩苷峰面積RSD值為1.41%，蘆丁峰面積RSD值為1.10%?？梢娋芏攘己?。

2.4 重現(xiàn)性試驗(yàn)結(jié)果

經(jīng)計(jì)算得到鹽酸小蘗堿RSD值為0.90%，黃芩苷RSD值為1.56%，蘆丁RSD值為1.61%?？梢姽┰嚻啡芤禾崛》椒ㄖ噩F(xiàn)性好。

2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

經(jīng)計(jì)算鹽酸小蘗堿RSD值為0.60%，黃芩苷峰面積RSD值為0.76%，蘆丁峰面積RSD值為0.89%。供試品溶液在室溫10h內(nèi)穩(wěn)定。

2.6 回收率試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)測(cè)定結(jié)果計(jì)算平均加樣回收率，其中鹽酸小蘗堿為98.5%（n＝9，平均RSD＝1.70%）；黃芩苷為98.1%（n＝9，平均 RSD＝1.10%）；蘆丁為101.1%（n＝9，平均 RSD＝1.87%）。本方法回收率高，分離效果好。結(jié)果見表1、表2和表3。

2.7 樣品測(cè)定結(jié)果

以既定含量測(cè)定方法測(cè)定供試品溶液中鹽酸小蘗堿、黃芩苷、蘆丁含量，色譜圖見圖2，測(cè)定結(jié)果見表4。鹽酸小蘗堿、黃芩苷和蘆丁的平均含量為0.368 1、2.155 6、1.167 1mg／g。結(jié)果表明該檢測(cè)方法穩(wěn)定可行。

表1 鹽酸小蘗堿加樣回收試驗(yàn)結(jié)果Table 1 Recovery test result of berberine hydrochloride

表2 黃芩苷加樣回收試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Recovery test result of baicalin

表3 蘆丁加樣回收試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Recovery test result of rutin

圖2 試驗(yàn)樣品高效液相色譜圖Fig.2 HPLC chromatogram of the test samples

表4 試驗(yàn)樣品含量測(cè)定結(jié)果Table 4 The contents determination results of the samples mg／g

3 討論

根據(jù)待測(cè)成分的相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道和紫外掃描圖譜分析，蘆丁的最大紫外吸收值主要在255nm和356 nm附近［7］，鹽酸小蘗堿的最大紫外吸收值主要在254nm和353nm附近［8］，黃芩苷主要在280nm和316nm附近［9］。因此，本試驗(yàn)主要考察了265nm、350nm兩個(gè)波長(zhǎng)的檢測(cè)效果，為達(dá)到三者兼顧的目的，最終采用了265nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。在此波長(zhǎng)下各成分均有較好的檢測(cè)效果。

試驗(yàn)首先在《中華人民共和國(guó)藥典》2005年版（一部）中蘆丁的高效液相色譜含量測(cè)定方法［10］基礎(chǔ)上，通過改進(jìn)后采用流動(dòng)相甲醇40mL／L∶冰醋酸（62∶38），等度洗脫為色譜分離條件。在此條件下，標(biāo)準(zhǔn)品分離良好（分離度＞1.5），但供試品溶液卻無法得到有效分離。通過參考相關(guān)文獻(xiàn)［11］和不斷摸索，最終通過更換流動(dòng)相為乙腈（B）－10mL／L冰醋酸水溶液（C），梯度洗脫（0→25min，B 20%→40%，C 80%→60%；25min→30min，B 40%→20%，C 60%→80%）等一系列方式，使得標(biāo)準(zhǔn)品和供試品溶液均得到了有效分離。

李文霞等［11］建立了三黃片中黃芩苷和鹽酸小檗堿的檢測(cè)方法，陳良等［12］建立了測(cè)定不同產(chǎn)地羅勒中蘆丁和槲皮素含量的方法。本試驗(yàn)的中藥復(fù)方透皮貼劑為一種新型專利藥物，對(duì)已有的多個(gè)藥物成分的檢測(cè)方法不完全適用。因此，為了確定該復(fù)方中有效成分的含量，本試驗(yàn)建立了同時(shí)測(cè)定其中3種不同主要有效成分鹽酸小蘗堿、黃芩苷、蘆丁含量的HPLC方法。本方法快速、準(zhǔn)確且專屬性強(qiáng)，對(duì)新藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的的建立和生產(chǎn)中的質(zhì)量控制具有一定的意義。

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