潘任桃，盧素云，劉兆穎，孫志良

（湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院 國(guó)家植物功能成分利用工程技術(shù)研究中心生物獸藥分中心，湖南長(zhǎng)沙410128）

大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌是引起感染的主要病原菌，為了有效的防治由大腸埃希菌、金黃色葡萄菌引起的感染，多采用聯(lián)合用藥的方式，獸醫(yī)臨床上有慶大霉素＋磷霉素，恩諾沙星＋頭孢三嗪，氟苯尼考＋鹽酸土霉素等［1－5］。隨著大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌對(duì)相關(guān)抗菌藥物敏感性降低，抗菌藥物的使用劑量也不斷加大［6］。茶皂素是從山茶科植物中提取出來的天然活性物質(zhì)［7－8］，具有代謝快、殘留少、毒性低等特性，可提高動(dòng)物機(jī)體免疫力，降低膽固醇含量，增加料肉比等優(yōu)點(diǎn)［9－10］，目前作為一種飼料添加劑廣泛應(yīng)用于養(yǎng)殖行業(yè)。茶皂素具有較強(qiáng)的殺釘螺［11］、殺 真 菌 能 力［12］，也 具 有 一 定 的 抗 細(xì) 菌 效果［13］，目前尚未見到關(guān)于茶皂素與抗菌藥物聯(lián)合用藥的研究報(bào)道，本試驗(yàn)旨在通過觀察茶皂素與相關(guān)抗菌藥物的聯(lián)合抑菌效果，探討動(dòng)物細(xì)菌性疾病治療的藥物組合。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥物與試劑 慶大霉素標(biāo)準(zhǔn)品，批號(hào)CDRC－G360595，由中國(guó)獸藥監(jiān)察所提供；氟苯尼考原料藥，批號(hào)200907001，寧夏太平洋生物制藥有限公司產(chǎn)品；恩諾沙星原料藥，批號(hào)Z05721－2，湖南麓谷醫(yī)藥制品有限公司產(chǎn)品；氨芐青霉素，批號(hào)B110－00614，上海創(chuàng)賽儀器有限公司產(chǎn)品；茶皂素，含量93.5%，湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)提供；瓊脂粉，批號(hào)100115，上海藍(lán)季科技發(fā)展有限公司產(chǎn)品；蛋白胨，批號(hào)080410，上海藍(lán)季科技發(fā)展有限公司產(chǎn)品；酵母粉，批號(hào)LP0021，英國(guó)Oxoid公司產(chǎn)品；營(yíng)養(yǎng)瓊脂，批號(hào)080310，北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司產(chǎn)品；氯化鈉，批號(hào)F20100330，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品；MTT試劑盒，批號(hào)C0009，碧云天生物技術(shù)研究所產(chǎn)品。

1.1.2 試驗(yàn)菌株 致病性大腸埃希菌和耐藥金黃色葡萄球菌，由湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸藥工程研究所提供。

1.1.3 主要儀器 SW－CJ－2FD型雙人單面凈化工作臺(tái)，蘇州凈化設(shè)備公司產(chǎn)品；LRH－250－S型恒溫恒濕培養(yǎng)箱，廣東省醫(yī)療器械廠產(chǎn)品；Infinite F50酶標(biāo)儀，瑞士TECAN；DHG－9240A型電熱鼓風(fēng)干燥箱，上海精宏試驗(yàn)設(shè)備有限公司產(chǎn)品；YXQ－LS－50SⅡ型立式電熱壓力蒸汽滅菌器，上海博迅公司醫(yī)療設(shè)備廠產(chǎn)品；HHSY11－Ni2型電熱恒溫水浴鍋，北京長(zhǎng)源實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠產(chǎn)品；AY22O型電子天平，日本Electronic Balance公司產(chǎn)品；微量可調(diào)移液器，德國(guó)Eppendorf公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 抗菌藥物儲(chǔ)備液的配置 準(zhǔn)確稱取慶大霉素、氟苯尼考、恩諾沙星，分別配置成濃度為3 000、1 600、480μg／mL 的 母 液；氨 芐 青 霉 素 稀 釋 成100μg／mL，備用。其中，氟苯尼考用酒精助溶，恩諾沙星用NaOH助溶。

1.2.2 菌懸液的配置 菌種復(fù)蘇，培養(yǎng)24h，平板計(jì)數(shù)法進(jìn)行細(xì)菌計(jì)數(shù)后，用LB培養(yǎng)基配置成1×105cfu／mL。

1.2.3 最小抑菌濃度測(cè)定

1.2.3.1 瓊脂稀釋法 瓊脂稀釋法藥敏試驗(yàn)和結(jié)果判讀按照新版CLSI［14］推薦的瓊脂稀釋法進(jìn)行，設(shè)置3個(gè)重復(fù)。分別測(cè)定慶大霉素、氟苯尼考、恩諾沙星、氨芐青霉素對(duì)大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC），菌懸液濃度為1×105cfu／mL，各藥物設(shè)置12個(gè)濃度，置37℃恒溫恒濕培養(yǎng)箱培養(yǎng)18h～24h，觀察結(jié)果，以無菌生長(zhǎng)的最低濃度為該藥單獨(dú)用藥時(shí)的MIC。

1.2.3.2 多孔板－MTT比色法 參照微量肉湯稀釋法測(cè)定各抗菌藥物單獨(dú)用藥時(shí)的MIC值。將各藥物以滅菌LB倍比稀釋成12個(gè)濃度，分別取100μL依次加入96孔板，再將1×105cfu／mL菌液100μL加入孔中，37℃過夜培養(yǎng)18h～24h，加入5mg／mL的MTT 10μL，繼續(xù)培養(yǎng)4h，加入100μL溶解液，培養(yǎng)15min，酶標(biāo)儀570nm處測(cè)定吸光值A(chǔ)。以被抑制達(dá)75%的孔的藥液質(zhì)量濃度作為該藥物的MIC值。各藥物濃度設(shè)置3個(gè)重復(fù)［14－15］。

1.2.4 聯(lián)合藥敏試驗(yàn) 采用多孔板－MTT比色法，按照棋盤法設(shè)置藥物濃度（3個(gè)重復(fù)），分別測(cè)定茶皂素與慶大霉素、氟苯尼考、恩諾沙星、氨芐青霉素的聯(lián)合體外抗菌活性，以各藥物對(duì)應(yīng)MIC值的2、1、1／2、1／4、1／8倍等濃度分別進(jìn)行聯(lián)合藥敏試驗(yàn)。置37℃恒溫恒濕培養(yǎng)箱培養(yǎng)18h～24h，觀察結(jié)果。

試驗(yàn)結(jié)果以分級(jí)抑菌濃度（fractional inhibitory concentration，F(xiàn)IC）指數(shù)作為聯(lián)合藥敏試驗(yàn)的判斷依據(jù)：FIC≤0.5為協(xié)同作用；0.5＜FIC≤1為相加作用；1＜FIC≤2為無關(guān)作用；FIC＞2為拮抗作用。

2 結(jié)果

2.1 單獨(dú)用藥的最小抑菌濃度

由表1可知，多孔板－MTT比色法和瓊脂稀釋法的結(jié)果一致率為87.5%；且與4種抗菌藥物相比，茶皂素的 MIC值較大，為0.8×105μg／mL。

2.2 體外聯(lián)合藥敏試驗(yàn)結(jié)果

由表2、表3可知，茶皂素與試驗(yàn)所用抗菌藥物表現(xiàn)為相加作用，聯(lián)合用藥后，慶大霉素、氟苯尼考、恩諾沙星、氨芐青霉素、茶皂素對(duì)大腸埃希菌的MIC值分別為單獨(dú)用藥的1／64、1／32、1／64、1／32、1／2；對(duì)金黃色葡萄球菌的MIC值分別為單獨(dú)用藥的1／32、1／8、1／4、1／8、1／2。

3 討論

多孔板－MTT比色法是通過細(xì)胞琥珀酸脫氫酶等將黃色的MTT變成紫色的甲臜，在OD 570nm處測(cè)定其吸光值，OD值的大小與活細(xì)胞含量成正比，死細(xì)胞沒有此功能，因此，MTT法可用于測(cè)定活細(xì)胞含量［14－15］。琥珀酸脫氫酶等是細(xì)胞代謝反應(yīng)中最基本的酶系之一，在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中僅存在于線粒體，參與三羧酸循環(huán)的脫氫反應(yīng)；而在細(xì)菌中，琥珀酸脫氫酶存在于質(zhì)膜、間體，因此MTT不僅可用于細(xì)胞試驗(yàn)，還可用于細(xì)菌、真菌試驗(yàn)，提示MTT可用于抗菌藥物MIC值測(cè)定［16－17］。且與瓊脂稀釋法相比，多孔板－MTT比色法所需樣品含量少，能對(duì)多個(gè)樣品進(jìn)行快速檢測(cè)，進(jìn)行結(jié)果判讀所得的MIC值更為準(zhǔn)確、客觀，結(jié)果可量化。

表1 5種藥物對(duì)大腸埃希菌和金黃色葡萄球菌的最低抑菌濃度Table 1 The MIC of five kinds of antimicrobials against E.coli and Staphylococcus aureus μg／mL

表2 茶皂素與4種抗菌藥物對(duì)大腸埃希菌的體外聯(lián)合試驗(yàn)Table 2 Sensitivity effects of tea saponin combined with four kinds of antimicrobials against E.coli in vitro μg／mL

表3 茶皂素與4種抗菌藥物對(duì)金黃色葡萄球菌的體外聯(lián)合試驗(yàn)Table 3 Sensitivity effects of tea saponin combined with four kinds of antimicrobials against Staphylococcus aureus in vitro μg／mL

單一用藥結(jié)果顯示，多孔板－MTT比色法與瓊脂稀釋法的結(jié)果一致率達(dá)到87.5%，因此在聯(lián)合用藥過程中，為了使結(jié)果更為準(zhǔn)確，加快試驗(yàn)進(jìn)度，采取多孔板－MTT比色法。從試驗(yàn)結(jié)果可看出，聯(lián)合用藥中FIC值都在0.5～1，屬于相加作用，藥物的MIC值較單獨(dú)用藥時(shí)的MIC值都有不同程度的降低：茶皂素聯(lián)合用藥時(shí)的MIC為單獨(dú)用藥的1／2，4種抗菌藥物聯(lián)合用藥時(shí)的MIC為單獨(dú)用藥時(shí)MIC的1／4～1／32，抗菌藥物的使用量都得到大幅度的降低。這4種抗菌藥物的殺菌機(jī)理各有差異，抑制蛋白質(zhì)的合成、阻礙DNA的復(fù)制、增大細(xì)胞壁的通透性［18－19］。聯(lián)合用藥中，茶皂素的增效作用可能是茶皂素的表面活性劑性質(zhì)［20］加大了抗菌藥物與細(xì)菌接觸的表面積，提高了抗菌藥物的有效作用濃度；也有可能是其對(duì)細(xì)菌造成的氧化性損傷［21］，增強(qiáng)了病原菌對(duì)抗菌藥物的敏感性。

由此可見，茶皂素與抗菌藥物聯(lián)合用藥，可擴(kuò)大抗菌藥物的抗菌譜、減少抗菌藥物的用量，可望治療混合感染。

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