楊勝男 ，王 娟，鄭增忍＊，張樂萃，曲志娜 ，黃秀梅，李玉清

（1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)，山東青島266109；2.中國動物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，山東青島266032）

空腸彎曲桿菌（Campylobacter jejuni）是彎曲桿菌屬的一種，是一種近十幾年來受到國內(nèi)外廣泛重視的人畜共患病病原菌，主要引起人體急性腸炎和食物中毒，并伴發(fā)反應(yīng)性關(guān)節(jié)炎、肝炎、瑞特氏病和格林－巴利綜合征等免疫性損傷性疾病。在獸醫(yī)臨床中，可引起家畜流產(chǎn)不孕、乳房炎及幼畜禽腹瀉和家禽肝炎［1－9］。自20世紀(jì)70年代起，空腸彎曲桿菌就是引起腸道感染的主要原因之一，由此引發(fā)的食品安全和食源性疾病問題日益突出，嚴(yán)重威脅人畜健康，成為公共衛(wèi)生關(guān)注的焦點(diǎn)［10］。隨著抗生素的廣泛不合理使用，彎曲桿菌耐藥性問題引起了世界的廣泛關(guān)注。因此，了解空腸彎曲桿菌的耐藥菌株情況，是保障公共衛(wèi)生及養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展的重要舉措。本試驗(yàn)對采集的樣品分離純化并對其進(jìn)行藥物敏感性試驗(yàn)分析。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 檢測樣本及來源 從青島地區(qū)不同屠宰場及農(nóng)貿(mào)市場采集雞盲腸（內(nèi)容物樣品），豬盲腸棉拭子（置于Cary－Blair半固體培養(yǎng)基中），共170份，低溫運(yùn)送至實(shí)驗(yàn)室。

1.1.2 試劑及培養(yǎng)基 CCDA瓊脂、哥倫比亞血瓊脂基礎(chǔ)購自英國OXOID公司；綿羊全血購自青島海博生物科技公司；Cary－Blair半固體培養(yǎng)基購自北京陸橋生物科技公司；Taq酶和DNA Marker購自寶生物工程（大連）有限公司；厭氧罐、微需氧產(chǎn)氣袋購自日本MGC公司；彎曲菌API鑒定條，E－Test藥敏試紙條（阿奇霉素、慶大霉素、四環(huán)素、環(huán)丙沙星、萘啶酸、紅霉素、氯霉素、克林霉素），均購自Biomerieux公司；常規(guī)試劑為國產(chǎn)分析純試劑。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌分離培養(yǎng) 用接菌環(huán)沾取少量盲腸內(nèi)容物或棉拭子劃線接種到CCDA選擇性培養(yǎng)基上，豬盲腸棉拭子直接劃線接種到CCDA選擇性培養(yǎng)基上，將接菌后的平板置于MGC厭氧罐中，根據(jù)厭氧罐容量2.5L／袋標(biāo)準(zhǔn)，放入微需氧產(chǎn)氣袋，此時(shí)容器內(nèi)約含二氧化碳5%～10%。隨后連同容器一并置于42℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。

1.2.2 分離純化 將分離培養(yǎng)的疑似菌落轉(zhuǎn)接于TTC瓊脂平板、哥倫比亞血平板純化培養(yǎng)，培養(yǎng)條件同上。

1.2.3 PCR檢測方法

1.2.3.1 PCR引物設(shè)計(jì) 根據(jù)GenBank公布的空腸彎曲桿菌16SrRNA基因序列的保守片段，設(shè)計(jì)引 物 序 列 如 下：正 向 引 物 F：5′－CATCTTCCCTAGTCAAGCCT－3′，反 向 引 物 R：5′－AAGATATGGCACTAGCAAGAC－3′。

1.2.3.2 模板DNA的提取 將哥倫比亞平板純化培養(yǎng)所得的細(xì)菌按照煮沸法提取DNA。

1.2.3.3 PCR 反應(yīng)體系 PCR 反應(yīng)體系：10×PCR buffer 2.5μL，Taq DNA 聚合酶（5U／μL）0.5μL，dNTP（2.5mmol／L）0.5μL，上下游引物（20pmol／μL）各0.5μL，模板DNA 1μL，無菌去離子水加至25μL。

1.2.3.4 PCR 擴(kuò) 增 條 件 94 ℃ 5min；94℃1min，64℃1min，72℃1min；94℃1min，62℃1min，72℃1min；94℃1min，60℃1min，72℃1min；94℃1min，58℃1min，72℃1min；94℃1min，56℃1min，72℃1min，以上5個(gè)梯度各2個(gè)循環(huán)；94℃1min，54℃1min，72℃1min，30個(gè)循環(huán)；72℃10min。PCR產(chǎn)物用15g／L瓊脂糖凝膠電泳，電泳后在凝膠成像系統(tǒng)中觀察、拍照。

1.2.4 菌種的保存 經(jīng)PCR及測序鑒定為空腸彎曲桿菌陽性菌株收集，置于含7%DMSO的MH肉湯中，置－80℃冷凍保存。

1.2.5 空腸彎曲桿菌的耐藥性檢測分析 根據(jù)臨床用藥情況和對公共衛(wèi)生的影響選擇6類8種抗菌藥物，按照美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會（CLSI）的標(biāo)準(zhǔn)，用E－Test藥敏試紙條檢測所有菌株對這6類8種抗菌藥物的最低抑菌濃度。6類8種抗菌藥物分別是大環(huán)內(nèi)酯類（阿奇霉素、紅霉素）；喹諾酮類（萘啶酸、環(huán)丙沙星）；氨基糖苷類（慶大霉素）；四環(huán)素類（四環(huán)素）；酰胺醇類（氯霉素）；林可霉素類（克林霉素）。對保存的38株空腸彎曲桿菌菌株根據(jù)E－Test測試條說明書進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌分離

空腸彎曲桿菌在CCDA選擇性培養(yǎng)基上生長出較小的圓形光滑、灰色閃金屬光菌落，有時(shí)沿接種線向外擴(kuò)散或容易連成串珠狀。經(jīng)涂片革蘭染色為革蘭陰性菌，形狀頗似逗點(diǎn)。

2.2 PCR試驗(yàn)結(jié)果

電泳結(jié)果顯示，該P(yáng)CR方法對空腸彎曲桿菌能擴(kuò)增出特異性片段。通過凝膠成像系統(tǒng)對該特異片段進(jìn)行遷移率計(jì)算，計(jì)算其大小為773bp。電泳結(jié)果見圖1。

2.3 細(xì)菌分離鑒定結(jié)果

共采集樣品170份，分離得到空腸彎曲桿菌38株，平均感染空腸彎曲桿菌陽性率為16.89%。其中，雞源樣品120份，其感染陽性率為18.33%，分離到22株空腸彎曲桿菌；豬源樣品50份，其感染陽性率為32%，分離到16株空腸彎曲桿菌。

圖1 PCR鑒定電泳結(jié)果Fig.1 Electrophoresis of PCR identification results

2.4 空腸彎曲桿菌藥敏試驗(yàn)結(jié)果

22株雞源空腸彎曲桿菌分離菌株對8種抗生素存在不同程度的耐藥性，大多數(shù)菌株對阿奇霉素、四環(huán)素、萘啶酸和克林霉素耐藥。對紅霉素耐藥率最高，達(dá)到100%，不到50%的菌株對環(huán)丙沙星、氯霉素耐藥，對慶大霉素較為敏感，敏感性可達(dá)80%以上（表1）。16株豬源空腸彎曲桿菌分離株對紅霉素耐藥率達(dá)到90%以上，對慶大霉素、四環(huán)素、萘啶酸耐藥率超過50%，對阿奇霉素、克林霉素較為敏感（表2）。

3 討論

本試驗(yàn)所采集的不同來源樣本均來自同一地區(qū)，但其分離率有一定差異，豬源分離率高于雞源分離率，很可能與養(yǎng)殖方式有關(guān)。目前，該地區(qū)雞的規(guī)?；B(yǎng)殖較為普遍，而豬還是以小規(guī)模散養(yǎng)為主，其飼養(yǎng)水平、飼養(yǎng)條件和衛(wèi)生狀況較規(guī)模化養(yǎng)殖還有一定差距，導(dǎo)致豬的帶菌水平較高。

藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果表明，雞源和豬源空腸彎曲桿菌大多數(shù)對紅霉素、四環(huán)素、萘啶酸耐藥，且都對紅霉素耐藥率最高，這可能與畜禽養(yǎng)殖中使用的飼料添加劑有關(guān)。雞源和豬源空腸彎曲桿菌對敏感藥物種類有較大區(qū)別，這可能與藥物的經(jīng)驗(yàn)臨床使用、用藥的頻率、強(qiáng)度有關(guān)。

表1 雞源22株空腸彎曲桿菌分離株藥敏感性檢測結(jié)果Table 1 The detecting results of antimicrobial susceptibility of 22 C.jejuni strains from chickens

表2 豬源16株空腸彎曲桿菌分離株藥敏感性檢測結(jié)果Table 2 The detecting results of antimicrobial susceptibility of 16 C.jejuni strains from swine

本試驗(yàn)分離的空腸彎曲桿菌幾乎對所有抗菌藥物都有不同程度的耐藥，其耐藥性的出現(xiàn)給臨床及獸醫(yī)用藥帶來了問題，更重要的是其耐藥性可通過食物鏈傳播，對動物尤其是人類的食品安全造成嚴(yán)重危害。針對目前細(xì)菌耐藥性逐漸增強(qiáng)的趨勢，一方面國家應(yīng)對抗生素的使用或添加制定更嚴(yán)格統(tǒng)一的限量標(biāo)準(zhǔn)，減少同一種藥物的使用頻率，嚴(yán)格進(jìn)行合理用藥；另一方面，應(yīng)從動物飼養(yǎng)的源頭抓起，鼓勵和發(fā)展集約化養(yǎng)殖，減少散戶養(yǎng)殖，加強(qiáng)飼料安全檢測，改善飼養(yǎng)和防疫條件，規(guī)范用藥，降低細(xì)菌耐藥性，保障動物產(chǎn)品安全，維護(hù)人類健康［11］。

［1］ Ang C W，Van Doorn P A，Endtz H P，et al.A case of guillainbarre syndrome following a family out break ofCampylobacterjejuni enteritis［J］.J Neuroimmunol，2000，11（2）：2229－2233.

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［10］ 孫長貴，譯.NCCLS抗微生物藥物敏感性試驗(yàn)執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)抗微生物藥物敏感性試驗(yàn)執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)［S］.2006版，第十六版信息增刊.

［11］ 娜仁高娃，陳 霞，吳聰明.雞源空腸彎曲菌和結(jié)腸彎曲菌的臨床分離及多重PCR鑒定［J］.中國獸醫(yī)雜志，2010，46（1）：38－39.