索南卓瑪

（青海省海南州同德縣畜牧獸醫(yī)工作站，青海同德813200）

羊痘（Capripox，CP）是由羊痘病毒（Capripox virus，CPV）引起山羊、綿羊的一種接觸性、急性、熱性傳染?。?－2］，以持續(xù)高熱、全身的皮膚和黏膜上發(fā)生特異性痘斑（疤疹、丘疹、淋巴結(jié)病變等）為主要臨床特征［3］。該病對(duì)全球養(yǎng)羊業(yè)和毛皮制造行業(yè)造成了極大的危害［4］，世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）將其列為必須報(bào)告的動(dòng)物疫病，我國(guó)也將其列為一類動(dòng)物傳染病，嚴(yán)重影響了我國(guó)羊類制品的出口貿(mào)易和國(guó)內(nèi)養(yǎng)羊業(yè)的健康發(fā)展［1，5］。CPV 屬痘病毒科（Poxviridae）脊椎動(dòng)物痘病毒亞科（Chordopoxvirinae）羊痘病毒屬（Capripoxvirus）［5］，基因組為雙股線性DNA病毒，P32蛋白由Chand等于1994年首次發(fā)現(xiàn)［6］，后續(xù)研究表明P32蛋白是位于CPV囊膜表面的一種主要結(jié)構(gòu)蛋白，含有主要的抗原表位，在病毒感染早期即可誘導(dǎo)體液免疫應(yīng)答和細(xì)胞免疫應(yīng)答，是激發(fā)機(jī)體產(chǎn)生抗體并產(chǎn)生保護(hù)性免疫的主要成分，是CPV中特異性高、免疫原性強(qiáng)的結(jié)構(gòu)蛋白，是目前羊痘病毒研究的熱點(diǎn)［7－10］。王芳 等［11］于 2009年表達(dá)了全長(zhǎng)P32蛋白，其表達(dá)的全長(zhǎng)P32蛋白用ELISA方法檢測(cè)時(shí)反應(yīng)性良好，但表達(dá)量非常低，增加了純化的難度和成本。截短表達(dá)P32蛋白的主要抗原區(qū)域基本不影響蛋白的免疫原性，陳軼霞等［12］截短表達(dá)的羊痘病毒P32蛋白可誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生特異性體液免疫應(yīng)答，并能刺激小鼠產(chǎn)生較強(qiáng)的細(xì)胞免疫應(yīng)答。鑒于此，本研究選擇P32蛋白抗原性好的主要區(qū)域進(jìn)行了表達(dá)，以期為CPV診斷方法的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病毒、載體、菌種、血清 CPV疫苗株、克隆菌株 DH5α、表達(dá)菌株 BL21（DE3）、表達(dá)載體pET32a（＋）均由青海省西寧市動(dòng)物疾病中心實(shí)驗(yàn)室保存；CPV參考陽(yáng)性、陰性血清購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。

1.1.2 試劑盒及工具酶 pMD18－T克隆載體、KpnⅠ和NotⅠ限制性內(nèi)切酶購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司；病毒基因組提取試劑盒、膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 引物的設(shè)計(jì)與合成 參照GenBank上發(fā)表的CPV基因組序列（HM572331.1）設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物，P1：5′－CGGGGTACCGAAATTTCAGATGTAGTTCCA－3′；P2 ：5′－ATTT GCGGCCGCGCTCCCATTATAC －T AATATCA－3′，下劃線部分表示引入的KpnⅠ和NotⅠ酶切位點(diǎn)，引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成合成。

1.2.2 病毒基因組DNA的提取 按病毒基因組提取試劑盒的使用說(shuō)明提取CPV基因組DNA。

1.2.3 P32基因片段的PCR擴(kuò)增 以提取的病毒基因組DNA為模板擴(kuò)增P32基因片段，PCR反應(yīng)條件為：95℃5min預(yù)變性；95℃45s，58℃45s，72℃1min，共進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；72℃10min，4℃終止反應(yīng)。取5μL PCR產(chǎn)物在10g／L瓊脂糖凝膠中電泳觀測(cè)結(jié)果。

1.2.4 P32基因片段的克隆及鑒定 PCR產(chǎn)物利用膠回收試劑盒回收純化后，與pMD18－T載體在4℃過(guò)夜連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑取單菌落接種于液體LB中，37℃振搖培養(yǎng)16h，利用質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒DNA，用KpnⅠ和NotⅠ雙酶切鑒定為陽(yáng)性克隆，送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行測(cè)序鑒定，測(cè)序正確的質(zhì)粒命名為pMD18－T－P32。

1.2.5 表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定 將質(zhì)粒pMD18－T－P32和原核表達(dá)載體pET32a分別用KpnⅠ和NotⅠ雙酶切后回收目的片段，利用T4DNA連接酶16℃過(guò)夜連接，次日連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑取單菌落接種于液體LB中，37℃振蕩培養(yǎng)16h，用質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒DNA，用EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切鑒定為陽(yáng)性重組質(zhì)粒，測(cè)序正確的質(zhì)粒命名為pET32a－P32。

1.2.6 重組蛋白的表達(dá)和純化 將質(zhì)粒pET32a－P32轉(zhuǎn)化感受態(tài)表達(dá)菌BL21（DE3）。挑取單菌落加入到液體LB中，當(dāng)OD 600nm達(dá)到0.6左右時(shí)加入IPTG至終濃度為1mmol／L，繼續(xù)培養(yǎng)5h后，6 000r／min離心10min，收集菌體沉淀，用PBS洗2遍，利用超聲破碎后，12 000r／min離心10min，分別收集上清和沉淀進(jìn)行SDS－PAGE電泳。對(duì)以包涵體形式表達(dá)的重組蛋白用8mol／L尿素變性溶解，采用6、4、2mol／L尿素及PBS梯度透析復(fù)性，復(fù)性后的蛋白采用鎳離子親和樹(shù)脂過(guò)柱純化，并進(jìn)行SDS－PAGE電泳分析。

1.2.7 重組蛋白的活性檢測(cè) 純化的重組蛋白先進(jìn)行SDS－PAGE電泳后，轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜上，用80g／L脫脂奶粉37℃封閉2h，用PBST洗滌膜3次后加入CPV陽(yáng)性血清（1∶100倍稀釋）37℃作用1h，用PBST洗滌膜3次后加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的兔抗羊IgG（1∶5 000倍稀釋）37℃作用1h，PBST洗滌膜3次后用二氨基聯(lián)苯胺（DAB）緩沖溶液進(jìn)行顯色。

2 結(jié)果

2.1 P32基因片段的PCR擴(kuò)增

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)10g／L瓊脂糖凝膠電泳后，在約837bp處有一特異性擴(kuò)增條帶，與預(yù)期擴(kuò)增片段大小相符（圖1）。

2.2 重組質(zhì)粒pMD18－T－P32的鑒定

質(zhì)粒經(jīng)KpnⅠ和NotⅠ雙酶切后得到2個(gè)片段，與預(yù)期大小相符（圖2），陽(yáng)性質(zhì)粒pMD18－T－P32送公司測(cè)序后的結(jié)果與參考毒株序列相同。

圖1 P32基因片段PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 Result of PCR amplification of P32gene

圖2 重組質(zhì)粒pMD18－T－P32雙酶切鑒定Fig.2 Identification of recombinant plasmid pMD18－T－P32 by double enzyme digestion

2.3 重組質(zhì)粒pET32a－P32的鑒定

質(zhì)粒經(jīng)KpnⅠ和NotⅠ雙酶切后得到2個(gè)片段，與預(yù)期大小相符（圖3），陽(yáng)性質(zhì)粒pET32a－P32測(cè)序后的結(jié)果表明其閱讀框正確。

2.4 重組蛋白的表達(dá)及純化

表達(dá)菌液按之前的誘導(dǎo)條件誘導(dǎo)表達(dá)后，離心菌體沉淀，超聲破碎細(xì)胞，通過(guò)SDS－PAG電泳表明重組蛋白以包涵體形式表達(dá)，包涵體經(jīng)尿素變性、復(fù)性處理后，用鎳離子親和樹(shù)脂過(guò)柱純化得到了較純的目的蛋白（圖4）。

2.5 重組蛋白的Western blot鑒定

純化后的重組蛋白先進(jìn)行SDS－PAGE電泳，然后轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜上，分別與CPV陽(yáng)性、陰性血清作用。該重組蛋白能與CPV陽(yáng)性血清發(fā)生特異性反應(yīng)，產(chǎn)生肉眼可見(jiàn)的條帶，而空載體表達(dá)菌與CPV陽(yáng)性血清不反應(yīng)，該重組蛋白與CPV陰性血清也不反應(yīng)（圖5）。

圖3 重組質(zhì)粒pET32a－P32酶切鑒定Fig.3 Identification of recombinant plasmid pET32a－P32by enzyme digestion

圖4 重組蛋白的SDS－PAGE分析Fig.4 SDS－PAGE analysis of recombination proteins

圖5 表達(dá)產(chǎn)物的免疫印跡分析Fig.5 Western blot of expressed products

3 討論

羊痘是動(dòng)物痘病最常見(jiàn)的病毒性疾病之一［5］，是動(dòng)物痘病毒病的典型代表。由于我國(guó)養(yǎng)羊業(yè)的發(fā)展，尤其是羊類制品的流行，人們對(duì)羊健康的關(guān)注度日益增強(qiáng)。為此，制定積極有效的預(yù)防措施，獲得及時(shí)準(zhǔn)確的疾病監(jiān)控信息，是控制該病傳播的重要基礎(chǔ)工作。這就要求研究人員建立起快速、簡(jiǎn)便、敏感的診斷方法，為預(yù)防和檢測(cè)該病的發(fā)生和傳播提供技術(shù)支持。羊痘病毒在我國(guó)普遍存在，對(duì)養(yǎng)羊業(yè)危害嚴(yán)重，應(yīng)該加強(qiáng)對(duì)該病毒的檢測(cè)和疾病的快速診斷。本研究利用原核表達(dá)系統(tǒng)成功表達(dá)了CPV P32蛋白。選擇合適的載體是目的基因能否成功表達(dá)的關(guān)鍵。pET表達(dá)系統(tǒng)是在大腸埃希菌中克隆和表達(dá)重組蛋白的最強(qiáng)大系統(tǒng)。本試驗(yàn)所采用的載體pET－32a具有T7強(qiáng)啟動(dòng)子和組氨酸標(biāo)簽，是一個(gè)專為外源基因在大腸埃希菌中表達(dá)而研發(fā)的高效原核表達(dá)系統(tǒng)，其表達(dá)的重組蛋白帶有6×His標(biāo)簽，可利用Ni＋與組氨酸結(jié)合的性質(zhì)直接純化表達(dá)的目的蛋白，基本上不影響目的蛋白的結(jié)構(gòu)與功能。大腸埃希菌表達(dá)目的蛋白的形式有兩種，即包涵體和可溶性蛋白。以包涵體形式表達(dá)的蛋白質(zhì)能夠避免細(xì)胞內(nèi)蛋白水解酶作用，有利于目標(biāo)蛋白的富集和分離純化。本研究選擇P32基因抗原性好的主要區(qū)域進(jìn)行了截短表達(dá)，結(jié)果得到了高效表達(dá)。本研究所表達(dá)的重組P32蛋白經(jīng)變性、復(fù)性、純化后，Western blot檢測(cè)表明純化的重組蛋白具有良好的抗原性與特異性，可以將純化后的蛋白用于相關(guān)診斷試劑盒的研究，為開(kāi)發(fā)CPV抗體診斷試劑奠定了基礎(chǔ)。

［1］ 江 楠，文 明，許樂(lè)仁，等.羊痘病毒致宿主細(xì)胞病變研究進(jìn)展［J］.動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2012，33（7）：75－80.

［2］ Das A，Babiuk S，McIntosh M T.Development of a loop－mediated isothermal amplification assay for rapid detection of capri－poxviruses［J］.J Clin Microbiol，2012，50（5）：1613－1620.

［3］ 黃 鶴，李應(yīng)國(guó)，肖進(jìn)文，等.羊痘病毒環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（LAMP）檢測(cè)方法的建立［J］.中國(guó)畜牧獸醫(yī)，2012，39（6）：72－75.

［4］ Beard P M，Sugar S，Bazarragchaa E，et al.A description of two outbreaks of capripoxvirus disease in Mongolia［J］.Vet Microbiol，2010，142（3－4）：427－431.

［5］ 趙志荀，吳國(guó)華，顏新敏，等.羊痘病毒及其疫苗研究進(jìn)展［J］.動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2010，31（4）：77－81.

［6］ Chand P，Kitching R P，Black D N.Western blot analysis of virus－specific antibody responses for capripox and contagious pustular dermatitis viral infections in sheep［J］.Epidemiol Infect，1994，113（2）：377－385.

［7］ Heine H G，Stevens M P，F(xiàn)oord A J，et al.A capripoxvirus detection PCR and antibody ELISA based on the major antigen P32，the homolog of the vaccinia virus H3Lgene［J］.J Immunol Meth，1999，227（1－2）：187－196.

［8］ 程振濤，岳 筠，周碧君，等.羊痘病毒P32基因生物信息學(xué)分析［J］.西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2011，20（8）：20－24.

［9］ 趙志荀，王建科，張 強(qiáng).羊痘病毒P32蛋白的研究進(jìn)展［J］.中國(guó)畜牧獸醫(yī)，2009，36（10）：129－133.

［10］ 張志成，陳 瓊，龐銀芳，等.羊痘病毒江蘇株P(guān)32基因的克隆與序列分析［J］.金陵科技學(xué)院學(xué)報(bào)，2010，26（4）：79－84.

［11］ 王 芳，雷 震，于 力.山羊痘病毒p32基因原核表達(dá)及間接ELISA抗體檢測(cè)方法的建立［J］.中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2009，31（12）：955－958.

［12］ 陳軼霞，才學(xué)鵬，景志忠，等.羊痘病毒P32基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建、表達(dá)及其免疫原性［J］.病毒學(xué)報(bào)，2008，24（2）：133－137.