焦 洋，姜 焱，王凱民，張常印，雷治海，唐泰山

（1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，江蘇南京210095；2.江蘇出入境檢驗檢疫局，江蘇南京210001）

豬傳染性胃腸炎病毒（Transmissible gastroenteritis virus，TGEV）、豬流行性腹瀉病毒（Porcine epidemic diarrhea，PEDV）和豬博卡病毒（Porcine bocavirus，PBoV）都是與豬腹瀉相關(guān)的腸道病毒。其中由PEDV和TGEV引起的高度接觸性腹瀉性疾病，其臨床癥狀、病理變化和流行病學(xué)極為相似，在臨床和組織病理學(xué)上很難區(qū)分［1］。二者流行病學(xué)和病理剖檢也極其相似，但兩種病原沒有共同的抗原性，不能交互免疫，但又能混合感染。

PBoV屬于細小病毒科博卡病毒屬，為單股線狀無囊膜 DNA 病毒，基因組約5 200bp［2］。目前已經(jīng)證實，多種博卡病毒，包括 HBoV、BPV、CnMV、GBoV能夠感染并且導(dǎo)致宿主發(fā)生急性腹瀉［3－7］。2010 年，Shan T L 等［8］在無臨床癥 狀的豬糞便樣品中檢測到PBoV的廣泛存在，陽性率為63.2%，說明PBoV可以在豬腸道中定殖并散毒。2012年胡軍勇等［9］在臨床腹瀉樣品中檢測到了PBoV，陽性率高達69.35%，說明PBoV在腹瀉豬腸道內(nèi)廣泛存在。目前的數(shù)據(jù)可以說明，PBoV與豬的腹瀉疫情有一定的相關(guān)性，但是不能證明PBoV是原發(fā)性病原或者對其他豬腹瀉病毒的暴發(fā)起到協(xié)同作用。

由于TGEV、PEDV這兩種病毒臨床上呈現(xiàn)出相似的癥狀，經(jīng)常會發(fā)生混合感染，而PBoV又與腹瀉疫情相關(guān)，為了評估PBoV與TGEV以及PEDV的流行是否有混合感染的現(xiàn)象，對這3種病毒進行了檢測。由于臨床診斷非常困難，因此必須依靠實驗室檢測技術(shù)進行鑒別診斷。以往的血清學(xué)診斷準確率低，病毒分離診斷方法雖然準確，但操作復(fù)雜，費時、費力。PCR方法因其具有快速、特異、靈敏、準確等優(yōu)點，現(xiàn)己經(jīng)廣泛應(yīng)用于畜禽傳染病的快速診斷，目前已有很多文獻報道使用單一PCR方法對腹瀉病毒進行檢測［10－11］。多重PCR技術(shù)是在同一PCR體系中加入多對引物，對多個目的基因同時進行擴增的分子生物學(xué)診斷方法，具有快速、敏感、特異、易于操作的優(yōu)點，可用一個樣品同時檢測多種病原體，達到對多種疾病的同步診斷，縮短檢測時間，減少試劑消耗。因此，本文開展了多重PCR檢測TGEV、PEDV、PBoV的方法研究，旨在建立同時快速鑒別診斷這3種病毒的方法，并應(yīng)用于臨床實踐中。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病毒與病料 TGEV、PEDV細胞毒，大腸埃希菌DH5α，由江蘇檢驗檢疫局動檢實驗室保存。豬博卡病毒陽性病料、豬偽狂犬病病毒（PRV）、豬藍耳病病毒 （PRRSV）、豬A群輪狀病毒（GAR）、豬圓環(huán)病毒（PCV），由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)傳染病實驗室提供。60份腹瀉豬的腸道糞便及組織黏液分別采自江蘇省常州、揚州等地的不同規(guī)?；i場。

1.1.2 主要試劑 瓊脂糖、胰蛋白胨、酵母提取物、溴化乙錠（EB）、無水乙醇（分析純）等試劑均購自南京生物工程有限公司；Trizol試劑，PCR試劑（包括反轉(zhuǎn)錄酶，核糖核酸酶抑制劑，5×RT buffer，10×PCR buffer，25mmol／L MgCl2、10mmol／L dNTPs和r Taq酶）、DNA標準DL 2 000，pMD18－T載體，限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ、HindⅢ，質(zhì)粒提取試劑盒，基因組DNA提取試劑盒，購自寶生物工程 （大連）有限公司。

1.1.3 主要儀器 PCR儀5331型，Eppendorf公司產(chǎn)品；核酸電泳儀，BIO－RAD公司產(chǎn)品；全自動凝膠成像系統(tǒng)，英國Syngene公司產(chǎn)品；高速離心機，Thermo公司產(chǎn)品；電子分析天平BP211型，Sartorius公司產(chǎn)品；分光光度計NoNoDROP1000型，Thermo公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計與合成 根據(jù)GenBank上發(fā)表TGEV、PEDV、PBoV基因序列，針對TGEV的S基因、PEDV M基因保守區(qū)及PBoV的NP1基因的5′端保守區(qū)，各設(shè)計一對引物，引物序列為TGEVS1：5′－GTGGTTTTGGTCGTAATGC－3′；TGEVS2：5′－ACACTGTGGCACCCTTACCT－3′，PEDVM1：5′－GTCTAACGGTTCTATTCCC－3′，PEDVM2：5′－TTATAGCCCTCTACAAGC－3′，PBoV －NP1：5′－GCAAGGACATCTCCGAAAC－3′，PBoV －NP2：5′－TGAATGCCAGTGAAACCC－3′?？?特 異擴增出目的條帶大小分別為1 060、462、258bp，引物由寶生物工程 （大連）有限公司合成。

1.2.2 病料的處理 用10mmol／L的PBS緩沖液將糞樣稀釋10倍，在渦旋儀上震蕩混勻后，于－70℃反復(fù)凍融3次。12 000r／min離心5min，取上清液備用。

1.2.3 RNA與DNA的提取

1.2.3.1 RNA 的提取 取 200μL 樣 品 加 入800μL Trizol，劇烈震蕩后，室溫靜置5min；加入200μL氯仿，劇烈震蕩，室溫靜置10min，于4℃12 000r／min離心15min；取上清500μL加入等量異丙醇，混合均勻，室溫靜置20min，12 000r／min離心15min；棄上清，加入1mL 750mL／L的乙醇，清洗沉淀，12 000r／min離心8min；棄上清，室溫干燥2min～5min，加入25μL RNase－free水溶解沉淀，即為所需RNA模板，于－70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3.2 DNA的提取 DNA的提取按Takara基因組DNA提取試劑盒說明書提取。

1.2.3.3 反轉(zhuǎn)錄合成cDNA 所提取模板RNA 8μL，加入特異下游引物 1μL、dNTP Mixture（10mmol／L each）1μL，混勻后65℃保溫5min后迅速在冰上急冷2min。在上述反應(yīng)液中加入5×PrimeScript buffer 4 μL，RNase Inhibitor（40U／μL）0.5 μL，PrimeScript Reverse Transcriptase 0.5μL，無RNase水5μL，共20μL反應(yīng)體系。反轉(zhuǎn)錄42℃50min。

1.2.4 多重PCR擴增條件的優(yōu)化 以TGEV、PEDV的cDNA以及PBoV的DNA的混合物作為模板，建立PCR反應(yīng)體系。采用25μL反應(yīng)體系：10×PCR buffer 2.5μL，dNTPs 2μL，MgCl22μL，r Taq酶0.5μL，TGEV－S1和 TGEV－S2各0.2μL，PEDV－M1和PEDV－M2各0.3μL，PBoV －NP1和PBoV－NP2各0.3μL，TGEV模板2μL，PEDV模板2μL，PBoV模板2μL，滅菌ddH2O 10.3μL。反應(yīng)程序為：94℃5min；94℃1min，55℃1min，72℃1min，30個循環(huán)；72℃10min。PCR產(chǎn)物經(jīng)14g／L瓊脂糖凝膠電泳檢測。

為了摸索不同條件對PCR反應(yīng)的影響，分別將聚合酶濃度設(shè)置在0.02、0.06、0.1、0.14、0.18U 共5個梯度，將dNTPs濃度設(shè)置在0.05、0.1、0.2、0.3、0.4mmol／L共5個梯度，MgCl2濃度設(shè)置在0.5、1、2、3、4mmol／L共5個梯度進行 PCR 反應(yīng)，選擇最佳反應(yīng)濃度。退火溫度在42℃～62.6℃范圍內(nèi)設(shè)置11個梯度。PCR產(chǎn)物經(jīng)14g／L瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.5 多重PCR方法的特異性試驗 以優(yōu)化的多重PCR 方法對 PEDV、TGEV、GAR、PRRSV 的cDNA模板，PCV、PRV、PBoV 的 DNA 模板及H2O空白進行PCR擴增，檢查該方法的特異性。

1.2.6 多重PCR方法的敏感性試驗 將TGEV、PEDV的cDNA和PBoV的DNA進行10倍倍比稀釋，檢測其敏感性。

1.2.7 多重PCR方法的初步應(yīng)用 采用建立的多重PCR方法對60份來自江蘇的送檢樣品進行檢測。

2 結(jié)果

2.1 多重PCR聚合酶濃度的確定

在25μL體系中，多重PCR擴增時可使用酶的濃度范圍為0.02U～0.18U，最佳濃度為0.1U（圖1）。

圖1 PEDV、TGEV和PBoV多重PCR最佳酶濃度的確定Fig.1 Determination of optimal DNA enzyme concentrations in PEDV，TGEV and PBoV multiplex PCR

2.2 多重PCR dNTPs濃度的確定

在25μL體系中，多重PCR擴增時dNTPs可使用濃度范圍為0.05～0.3mmol／L，最佳濃度為0.2mmol／L（圖2）。

圖2 PEDV、TGEV和PBoV多重PCR最佳dNTPs的確定Fig.2 Determination of optimal dNTP concentrations in PEDV，TGEV and PBoV multiplex PCR

2.3 多重PCR MgCl2濃度的確定

在25μL體系中，多重PCR擴增時MgCl2濃度在1mmol／L～4mmol／L范圍內(nèi)可擴增出特性條帶，但擴增的最佳濃度為2mmol／L（圖3）。

圖3 PEDV、TGEV和PBoV多重PCR最佳MgCl2濃度的確定Fig.3 Determination of optimal MgCl2concentrations in PEDV，TGEV and PBoV multiplex PCR

2.4 多重PCR退火溫度的優(yōu)化

在42、42.2、43.3、45.2、47.4、50.0、52.8、55.5、58.0、60.1、61.7、62.6℃的退火溫度條件下進行多重PCR擴增，結(jié)果表明，多重PCR反應(yīng)退火溫度在42℃～62.6℃的范圍內(nèi)都可擴增出特異性條帶，而52.8℃時擴增效果最好（圖4）。產(chǎn)物擴增片段與預(yù)期片段大小相符。

2.5 多重PCR的特異性

采用優(yōu)化的PCR反應(yīng)條件，分別對PEDV、TGEV、GAR、PRRSV 的cDNA 模 板，PCV、PRV、PPV、PBoV的DNA模板以及陰性對照進行PCR擴增。結(jié)果顯示，只有用PEDV、TGEV、PBoV、PEDV、TGEV和PBoV的模板擴增得到特異性擴增產(chǎn)物，而GAR、PRRSV、PCV、PRV及陰性對照未見擴增產(chǎn)物（圖5），證明該方法具有良好的特異性。

2.6 多重PCR的敏感性

在優(yōu)化的PCR反應(yīng)條件下，TGEV的最高敏感度為35pg，PEDV的最高敏感度為20pg，PBoV的最高敏感度為10pg（圖6）。

2.7 多重PCR方法的初步應(yīng)用

采用建立的多重PCR方法與常規(guī)PCR方法對60份臨床病料樣品進行檢測，結(jié)果表明，1份TEGV陽性，陽性率為1.6%；4份PEDV陽性，陽性率為6.7%；13份PBoV陽性，陽性率為21.7%（圖7）。

3 討論

本研究建立的TGEV、PEDV、PBoV多重PCR檢測方法，特異性強，敏感性高，節(jié)省時間，使原本需要3d以上的檢測時間縮短為1d，而且節(jié)約成本，可以在同一體系中同時檢測3種病毒，大大降低了檢測成本，為感染的調(diào)查研究提供了簡便、快速、準確的檢測方法，顯示出其重要的實際應(yīng)用價值。試驗基于TGEV、PEDV、PBoV的保守基因合成了3對引物，并在同一體系中應(yīng)用多重PCR技術(shù)可以成功擴增出1 060、462、258bp的特異性片段。該多重PCR方法具有良好的特異性、敏感性和重復(fù)性。并且試驗選擇的TGEV的S基因、PEDV的M基因以及PBoV的NP1基因都是各自病毒的保守基因，擴增到這些基因片段能代表被檢樣品中存在該病毒。

建立多重PCR檢測方法的關(guān)鍵是實驗條件的優(yōu)化，即不僅要考慮引物設(shè)計和反應(yīng)條件［12］，同時還要注意各個擴增片段的大小，本試驗中目的片段均間隔100bp以上，擴增結(jié)果顯示目的條帶在瓊脂糖凝膠電泳后易于區(qū)分，且無非特異性擴增產(chǎn)物出現(xiàn)。應(yīng)用本研究建立的方法對60份臨床病料進行了檢測，檢出1份樣品為TEGV陽性，陽性率為1.6%；4份為PEDV 陽性，陽性率為6.7%；13份為PBoV陽性，陽性率為21.7%。由于PBoV的陽性率較高，將8份陽性樣品的PCR產(chǎn)物送至寶生物工程（大連）有限公司進行測序，利用NCBI中Blast軟件對所測序列進行了比對，結(jié)果顯示，8份樣品的PBoV的NP1基因序列與參考毒株（HQ223038.1）的同源性達98%～99%。測序結(jié)果進一步證明建立的多重PCR檢測方法具有良好的特異性，可用于臨床樣品檢測。這60份臨床樣品的檢測結(jié)果還沒有發(fā)現(xiàn)混合感染的現(xiàn)象，可能PBoV不會加劇TGEV以及PEDV的流行。但是由于目前檢測樣品數(shù)量的限制，還不能確切說明問題，還要進一步進行臨床樣品的收集與檢測。

圖4 多重PCR最佳退火溫度的確定Fig.4 Determination of optimal Annealing temperature in multiplex PCR

圖5 多重PCR特異性試驗Fig.5 Specificity assay of multiplex PCR

圖6 多重PCR敏感性試驗Fig.6 Sensitivitity assay of multiplex PCR

圖7 部分樣品的多重PCR擴增結(jié)果Fig7 The multiplex PCR result of clinical sample

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