張永斌，劉曉秋，陳 嘉，伍軍軍，李守軍

（1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗動物中心，廣東廣州510405；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)脾胃研究所，廣東廣州510405；3.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，廣東廣州510642）

糖尿?。―iabetes mellitus，DM）是最常見的慢性病之一，各型糖尿病的發(fā)病率逐年上升［1］。目前各種糖尿病并發(fā)癥的防治已成為糖尿病研究的重要課題，糖尿病的發(fā)生和發(fā)展與脾胃、胃腸損傷關(guān)系密切，糖尿病胃腸損傷常影響口服降糖藥物和其他藥物的療效，以及食物的代謝吸收，進(jìn)而影響糖尿病的進(jìn)程［2］。胃腸黏膜在胃腸腔和胃腸上皮之間起著半滲透屏障作用，胃腸黏蛋白（mucin，MUC）是胃腸黏膜的主要結(jié)構(gòu)單元，由胃腸上皮細(xì)胞（包括黏液頸細(xì)胞、杯狀細(xì)胞等）分泌，MUC1是胃腸黏膜MUC家族的主要成員，是上皮細(xì)胞表面跨膜糖蛋白，一氧化氮合酶（Nitric oxide synthase，NOS）存在結(jié)構(gòu)性NOS（cNOS）和誘導(dǎo)型 NOS（iNOS）。在糖尿病狀態(tài)下胃腸黏膜MUC、NOS均發(fā)生顯著變化，在胃腸黏膜的損傷和修復(fù)中MUC、NOS之間存在間接和直接的相互作用，如 Phillipson M 等［3－4］發(fā)現(xiàn)，MUC的缺陷與NOS的缺陷有依從關(guān)系，iNOS缺陷常伴隨MUC缺陷，致使黏膜層變薄，黏膜層MUC的累積降低。為進(jìn)一步探討糖尿病狀態(tài)下MUC1和iNOS在胃組織的表達(dá)水平及補(bǔ)中益氣丸的作用，利用鏈脲佐菌素（streptozocin，STZ）腹腔注射結(jié)合乙醇灌胃建立了糖尿病大鼠胃黏膜損傷模型，通過免疫組化的方法，動態(tài)觀察了胃組織中MUC1和iNOS的表達(dá)，為中醫(yī)脾胃理論、中藥復(fù)方作用機(jī)理的研究提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗動物 SPF級SD大鼠100只，雄性，體重180g～220g，購自廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗動物中心，許可證號：SCXK（粵）2008－0020。

1.1.2 試劑 補(bǔ)中益氣丸顆粒為九芝堂股份有限公司產(chǎn)品；鏈脲佐菌素（streptozocin，STZ）為美國Sigma公司產(chǎn)品；兔抗鼠MUC1多克隆抗體和兔抗鼠iNOS多克隆抗體均為北京博奧森生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；DAB顯色試劑盒為武漢博士德生物工程有限公司產(chǎn)品。

1.1.3 主要儀器 穩(wěn)豪血糖儀為強(qiáng)生中國醫(yī)療器材有限公司產(chǎn)品；Olympus系統(tǒng)生物顯微鏡為日本奧林巴斯株式會社產(chǎn)品；TS－8型轉(zhuǎn)移脫色搖床為江蘇海門市其林貝爾儀器制造有限公司產(chǎn)品；CU－420型電熱恒溫水浴箱為上海一恒科技有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 動物模型的建立 大鼠禁食不禁水12h后，腹腔注射STZ（用0.1mol／L，pH 4.2的檸檬酸鈉－檸檬酸緩沖溶液配制成10g／L的溶液），劑量55 mg／kg，在STZ注射72h后監(jiān)測隨機(jī)血糖，連續(xù)3次血糖值≥16.8mmol／L，且有多飲、多尿，多食癥狀，入選糖尿病動物模型，糖尿病造模同時灌胃300mL／L乙醇，劑量10mL／kg，連續(xù)4周。

1.2.2 動物分組及處理 大鼠隨機(jī)分為正常組24只，DM造模組76只，造模4周后，各組各處死6只動物取胃稱重并作胃黏膜檢查，將造模組中入選糖尿病動物模型并伴胃腸道癥狀的大鼠隨機(jī)分為模型組18只，糖尿病＋補(bǔ)中益氣丸組18只（簡稱中藥組，下同）。各組動物從試驗第5周起開始給藥并每月監(jiān)測隨機(jī)血糖一次，正常組及模型組等體積生理鹽水（20mL／kg）灌胃，連12周，中藥組給予補(bǔ)中益氣湯灌胃，3.75g／kg，連12周。

1.2.3 標(biāo)本提取及處理 試驗第8周、12周和16周末，正常組、模型組和中藥組各選6只動物（空腹12h）稱重后頸椎脫臼處死，開腹迅速取出胃并稱重，計算胃重量指數(shù)（胃重量指數(shù)＝胃重量／體重×100%），剪取胃組織作40mL／L多聚甲醛固定。

1.2.4 病理觀察 胃組織100mL／L甲醛固定后石蠟包埋，制備4μm切片進(jìn)行HE染色，觀察胃黏膜損傷及修復(fù)變化。

1.2.5 免疫組化染色方法 4μm石蠟切片脫蠟水化，抗原修復(fù)，阻斷過氧化物酶活性，分別滴加MUC1（1∶75）、iNOS（1∶75）4℃孵育過夜，再滴加二抗IgG于37℃孵育20min，DAB顯色，蘇木素復(fù)染2min，胞漿棕黃色顆粒沉著的為陽性細(xì)胞，讀片時每張片子取上下左右中5個黏膜區(qū)域拍照，應(yīng)用Image－Pro Plus 6.0病理圖象分析軟件測定各組胃黏膜免疫陽性產(chǎn)物的吸光值（OD值），每張切片隨機(jī)測定5個視野，同時測定同一張切片上胃組織的OD值作為背景，免疫反應(yīng)產(chǎn)物的OD值減去背景OD值得到校正的OD值（COD值），即為各陽性產(chǎn)物的實(shí)際吸光度值，然后求平均值作為該樣本的COD值。

1.2.6 統(tǒng)計學(xué)分析 應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計量資料以ˉx±SD表示，多樣本均數(shù)比較采用單因素方差LSD檢驗。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠臨床觀察

注射STZ后，造模大鼠約有72%的動物出現(xiàn)血糖持續(xù)升高并陸續(xù)發(fā)生死亡，糖尿病大鼠毛色枯黃無光澤，毛態(tài)豎立，精神倦怠，體型消瘦，飲水排尿增多，懶動等癥狀，模型組大鼠在試驗期間的血糖值與正常組比較均顯著升高（P＜0.01），提示糖尿病實(shí)驗?zāi)Ｐ统晒Γū?），中藥組經(jīng)補(bǔ)中益氣丸治療后，大鼠癥狀有所改善，但血糖值與模型組比較無明顯差異（P＞0.05）。

表1 各組大鼠血糖比較Table 1 Comparison of blood glucose in rats of three groups mmol／L

2.2 試驗各組大鼠胃重量指數(shù)變化

造模4周后，模型組和治療組大鼠均出現(xiàn)胃腸功能紊亂，剖檢發(fā)現(xiàn)胃黏膜有點(diǎn)狀、條索狀糜爛和出血灶，隨病程加長，模型組和中藥組胃壁變薄，變輕，模型組胃重量指數(shù)逐漸下降，在試驗12周時與正常組比較差異顯著（P＜0.05），16周時差異極顯著（P＜0.01），并見有潰瘍，中藥組重量指數(shù)下降較模型組緩慢，在16周時與正常組比較差異顯著（P＜0.05）（表2）。從血糖水平、胃黏膜肉眼觀察結(jié)果顯示，已初步建立了較穩(wěn)定的糖尿病大鼠胃黏膜損傷模型（表2）。

2.3 病理觀察結(jié)果

正常組大鼠胃黏膜上皮細(xì)胞連續(xù)性好，腺體排列整齊，黏膜層次結(jié)構(gòu)清楚，黏膜肌層和黏膜下層未見毛細(xì)血管擴(kuò)張淤血。模型組大鼠胃黏膜層上皮細(xì)胞黏液變薄、缺失、細(xì)胞間隙變大、有輕度的壞死，胞漿有空泡變性形成，毛細(xì)血管可見有擴(kuò)張，炎細(xì)胞浸潤。中藥組大鼠胃黏膜病變稍輕，未見明顯壞死。

表2 各組大鼠胃重量指數(shù)比較Table 2 Comparison of stomach weight index in rats of three groups

2.4 各組動物胃組織iNOS陽性表達(dá)結(jié)果

模型組MUC1陽性表達(dá)隨病程進(jìn)展而降低，第8、12周的MUC1陽性表達(dá)與正常組比較，差異顯著，第16周時差異極顯著（P＜0.01，圖1）。中藥組MUC1陽性表達(dá)高于模型組，但兩組間比較無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），中藥組在12周時有所上升，與正常組比較無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）（表3）。

表3 各組大鼠胃組織MUC1表達(dá)的比較Table 3 Comparison of MUC1of gastric tissue in rats of three groups

圖1 各組大鼠MUC1的表達(dá)情況（400×）Fig.1 Expression of MUC1in gastric tissue in rats of three groups（400×）

2.5 各組動物胃組織iNOS陽性表達(dá)結(jié)果

模型組陽性表達(dá)在第4周時明顯降低（表4），與正常組比較差異顯著（P＜0.05），第8周后明顯升高，第8、16周的陽性表達(dá)與正常組比較差異顯著（P＜0.05，圖2）。中藥組在第8周、12周和16周的iNOS陽性表達(dá)有所上升高，但與正常組比較無顯著差異（P＞0.05）。

表4 各組大鼠胃組織iNOS表達(dá)的比較Table 4 Comparison of iNOS of gastric tissue in rats of three groups

圖2 各組大鼠iNOS的表達(dá)情況（400×）Fig.2 Expression of iNOS in gastric tissue in rats of three groups（400×）

3 討論

建立糖尿病動物模型常采用大鼠腹腔注射STZ損毀胰島β細(xì)胞的方法建立［5－6］，本試驗采用腹腔注射STZ結(jié)合300mL／L乙醇灌胃方法制作糖尿病大鼠胃黏膜損傷模型，造模后大鼠普遍出現(xiàn)毛色枯黃、精神倦怠、體型消瘦、飲水排尿增多、懶動、便溏等癥狀，剖檢見胃黏膜充血和點(diǎn)狀出血，隨病程延長，胃壁變薄。糖尿病大鼠的臨床癥狀及胃黏膜組織學(xué)檢查結(jié)果顯示，本試驗已成功制作出糖尿病大鼠胃黏膜損傷模型。

MUC與其他蛋白質(zhì)相互作用共同完成體內(nèi)組織的屏障、修復(fù)及愈合等作用［7］，有大量保護(hù)性蛋白在黏膜表面的黏附層，這些蛋白質(zhì)與MUC一同分泌，通過蛋白結(jié)構(gòu)域和糖基化位點(diǎn)，與MUC相互作用，或從黏膜凝膠提供的粘彈性水溶液環(huán)境中獲益，影響它們的防御作用。iNOS活性更易受到多水平的調(diào)節(jié)，包括轉(zhuǎn)錄、翻譯、翻譯后修飾、蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)相互作用［8］，在極化的上皮細(xì)胞和在離子轉(zhuǎn)運(yùn)體附近的腸腔膜，iNOS與支架蛋白EBP50相互作用，將激活或抑制細(xì)胞因子誘導(dǎo)的iNOS。在糖尿病狀態(tài)，大鼠胃黏膜的 MUC1、iNOS均發(fā)生顯著變化，模型組MUC1隨病程進(jìn)展逐漸降低，模型組大鼠iNOS活性在STZ注射4周后顯著降低，胃體黏膜顯示大量的出血性損傷，隨病程進(jìn)展，胃黏膜iNOS活性顯著增強(qiáng)，持續(xù)催化產(chǎn)生大量NO，致使黏膜變薄，黏膜層 MUC累積降低，與 Lee D L等［9－10］報道基本一致。上述結(jié)果表明iNOS在糖尿病胃黏膜損傷方面起著重要作用，MUC、NOS之間可能存在間接和直接的相互作用，有待進(jìn)一步驗證。

中醫(yī)藥防治糖尿病（消渴?。┑臍v史悠久，經(jīng)驗豐富。“脾”與“胰”的關(guān)系密切，脾虛是糖尿病的重要病機(jī)。補(bǔ)中益氣湯是益氣健脾的代表方，古有“醫(yī)王湯”之稱，臨床上應(yīng)用補(bǔ)中益氣湯加味治療胃潰瘍、糖尿病性胃輕癱、糖尿病性腹瀉等病證，均取得了較好的療效。如王雪、周黎等［11－12］用于治療糖尿病性胃輕癱，陳青、汪何等［13－14］用于治療糖尿病性腹瀉均取得較好療效。許家騮等［15］發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)中益氣湯的精制顆粒、湯劑、丸劑均對無水乙醇、消炎痛等所致大鼠急性胃黏膜損傷及幽門結(jié)扎性胃潰瘍模型有明顯保護(hù)作用，三者均能明顯升高腺胃部組織前列腺素（prostaglandins，PGs）含量。在本試驗中，補(bǔ)中益氣丸能調(diào)節(jié)MUC1和iNOS的相互作用及表達(dá)，阻止胃黏膜損傷和糖尿病的進(jìn)一步發(fā)展。中藥復(fù)方作為一種天然的復(fù)雜體系，為調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)相互作用提供了可能性，在調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)相互作用方面有待進(jìn)一步深入研究。

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