楊小燕，劉建奎，魏春華，戴愛玲，李曉華

（福建龍巖學院生命科學學院／預防獸醫(yī)學與生物技術福建省高等學校重點實驗室／福建省人畜寄生與病毒性疫病防控工程技術研究中心，福建龍巖364000）

豬瘟（Classical swine fever，CSF）是由豬瘟病毒（Classical swine fever virus，CSFV）引起豬的一種以高熱稽留、出血和高病死率為特征的高度接觸性傳染病［1－2］，是嚴重威脅養(yǎng)豬業(yè)的主要病毒性疾病之一，世界動物衛(wèi)生組織（OIE）將其列為必須報告的動物疫病，中國將其列為一類動物疫病。目前，豬瘟在50多個國家和地區(qū)都有不同程度的發(fā)生與流行［3－4］。

CSFV是有囊膜的RNA病毒，基因組長約12.3 kb，含一個大的開放閱讀框（ORF），從5′端至3′端，CSFV的ORF可順次翻譯成衣殼蛋白C和囊膜糖蛋白E2、E1、E3等4種結構蛋白，以及4種非結構蛋白［5］。其中E2基因長度為1 110bp，全長由370個氨基酸殘基組成［6－7］，是3種囊膜糖蛋白中最主要的保護性抗原，也是中和抗體主要誘發(fā)者。

在中國，由于C－株疫苗的長期使用，有效的控制了豬瘟的流行，近些年來，豬瘟的流行特點出現(xiàn)了以溫和型豬瘟和母豬持續(xù)感染引起的流產(chǎn)、死胎、新生仔豬死亡為主的新變化，并呈現(xiàn)上升趨勢。從而導致許多豬場將疫苗劑量加大數(shù)倍，疫情依然不能控制［8－9］。2005年，廖素環(huán)等研究表明，廣西流行毒株與HCLV、Shimen的同源性比較低，表明廣西近期流行CSFV與兩個標準對照毒株之間存在較大差異，但廣西毒株之間同源性高。2006年，曲永利等對流行于國內(nèi)部分地區(qū)的9株豬瘟病毒E2基因進行擴增并分析，結果表明近期流行毒株的變異呈現(xiàn)一定的多樣性，并且多數(shù)毒株已向遠離疫菌株方向變異。楊健等［10］試驗結果初步證實，豬瘟病毒貴州流行株E2基因發(fā)生了較大的變異，且與疫苗毒株之間差異較大。因此，本研究在國內(nèi)外對CSFV E2基因編碼的抗原結構研究的基礎上，對福建流行毒株的核酸序列進行分析研究，構建遺傳進化樹，了解豬瘟病毒疫苗毒株與流行毒株之間的差異及流行毒株的變異情況，為防控豬瘟提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料 采集福建省某豬場疑似豬瘟樣品（扁桃體、脾、腎、淋巴結等），將采集的病料經(jīng)過研磨、離心、過濾，接種PK－15細胞，盲傳3代后用CSFV E2引物進行RT－PCR擴增。

1.1.2 菌種、載體和試劑 大腸埃希菌DH5α菌種由病原微生物實驗室保存；RNA酶抑制劑（40U／μL）、M－MuLV 反轉錄酶（200U／μL）、rTaq DNA聚合酶（5U／μL）、pMD18－T克隆載體試劑盒、DNA Marker DL 2 000為寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品；Trizol Reagent為Invitrogen公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 引物的設計與合成 針對E2基因設計了2對特異性引物，第1對引物P1、P2引用歐盟豬瘟參考實驗室推薦的用于CSFV診斷的E2部分基因片段的擴增，擴增片段長度為272bp，引物序列：P1：5′－TCRWCAACCAAYGAGATAGGG－3′，P2：5′－CACAGYCCRAAYCCRAAGTCATC－3′；第 2 對 引 物P3、P4用于CSFV E2全長基因的擴增，預期擴增片段 長 度 為 1 110bp，引 物 序 列：P3：5′－CAGCCAGCGCGTTATACCTCAT －3′，P4：5′－ACAACGCCATCTCTGT TACAGTCC－3′。引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。

1.2.2 RNA的提取 將細胞培養(yǎng)物反復凍融3次，離心后取上清液，用Trizol試劑盒提取病毒基因組RNA。

1.2.3 CSFV E2擴增 應用 M－MuLV反轉錄酶試劑盒說明書將提取的病毒基因組RNA反轉錄為cDNA。以cDNA為模板，進行PCR擴增。PCR反應體系為25μL：10×PCR buffer（Mg2＋）2.5μL，dNTPs （2.5mmol／L）1 μL，上、下 游 引 物（20mmol／L） 各 0.5 μL，TaqDNA 聚 合 酶0.25μL，用滅菌去離子水補至25μL。PCR反應程序：94℃5min；94℃45s，56℃45s，72℃ 60s，35個循環(huán)；72℃10min。用10g／L瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.4 測序 目的片段經(jīng)凝膠回收試劑盒回收純化，將其克隆入pMD18－T載體中，構建重組質粒，按常規(guī)方法轉化入DH5α中，經(jīng)酶切鑒定后，交由上海生工生物工程技術服務有限公司測序，測序結果與標準株及國內(nèi)分離株的序列進行比較分析。

2 結果

2.1 臨床樣品RT－PCR結果

取病毒基因組RNA，利用第1對引物P1、P2進行E2基因的RT－PCR擴增，經(jīng)電泳檢測證明均獲得約272bp的擴增產(chǎn)物，與預期片段大小相符，結果見圖1。

2.2 E2全長基因的克隆

取病毒基因組RNA，利用第2對引物P3、P4進行E2全長基因的RT－PCR擴增。經(jīng)電泳檢測證明均獲得約1 110bp的擴增產(chǎn)物（圖2），與預期片段大小相符，將回收的PCR產(chǎn)物克隆到pMD18－T載體。重組質粒經(jīng)雙酶切鑒定，篩選出陽性重組子pMD18－T－E2。

2.3 E2基因同源性分析

對野毒株E2基因與經(jīng)典強毒株，Alfort 187（x87939）、 Alfort A19 （U90951）、Shimen（AF092448）、Breseia（AF09166l）和弱毒疫苗株，中國C株（Z46258）、HCLV（AF091507）以及地方分離株廣州株 GZ2009（HQ380231）、江西株Jiangxi（EF683616）、廣西株 Guangxi（EF014338）、GXBH株 （EF014327）的核苷酸序列進行同源性分析。結果顯示，福建野毒株與中國C株、HCLV株、Shi－men、Alfort187、Alfort A19、Breseia 6株標準參考株 的 同 源 性 分 別 為 94.2%、94.4%、91.5%、92.3%、92.3%、90.7%；與國內(nèi)分離 株 GZ2009、Guangxi、Jiangxi、GXBH分離株的同源性分別為91.8%、93.1% 、81%、98.1%，將該野毒株命名為FJ－1株。

圖1 CSFV E2基因的RT－PCR檢測Fig.1 Detection of CSFV E2gene by RT－PCR

圖2 E2全長基因的RT－PCR擴增Fig.2 Amplification of full－length E2gene by RT－PCR

2.4 E2基因遺傳進化樹構建

FJ－1株E2基因序列與中國C株、HCLV、Alfort／187、Breseia等6株標準參考株和廣州株GZ2009等4株國內(nèi)分離株的E2序列的遺傳進化樹分析，結果見圖3。從進化樹可看出E2基因差異較大，明顯分為2支，Jiangxi分離株處在一個獨立的分支上；6株標準參考株GZ2009株、Guangxi株、GXBH株差異不大，同處于一個分支；而FJ－1株與其他毒株差異較大，處于同一主干的另一分支。這說明國內(nèi)CSFV毒株之間在進化上存在著某些相關性，可能與國內(nèi)地域間生豬貿(mào)易有關。

2.5 FJ－1株與C株E2推導氨基酸序列的變異分析

對CSFV FJ－1株與C株的E2基因的A、B、C、D 4個結構域蛋白氨基酸序列的分析顯示，在A抗原區(qū)有21個氨基酸發(fā)生了變異，分別由705（N→K）、713（A→V）、714（9I→T）、715（R→Q）、768（P→S）、796（E→G）、834（Y→H）、837（P→L）、838（E→K）、843（P→L）、845（P→K）、850（T→A）、852（N→S）、856（G→V）、857（P→L）、858（L→S）、859（R→G）、861（V→F）、862（W→L）、865（V→L）、866（P→L）；在B抗原區(qū)有4個氨基酸發(fā)生了變異，由705（N→K）、713（A→V）、714（I→T）、715（R→Q）；在C抗原區(qū)有6個氨基酸發(fā)生了變異，分別由705（N→K）、713（A→V）、714（I→T）、715（R→Q）、768（P→S）、796（E→G）；在D抗原區(qū)有2個氨基酸發(fā)生了變異，分別由768（P→S）、796（E→G）。

圖3 CSFV E2基因的系統(tǒng)遺傳進化樹Fig.3 Phylogenetic tree of CSFV E2gene

2.6 FJ－1株與C株E2蛋白抗原性及表面抗原位點的差異分析

應用DNAStar軟件對FJ－1株的E2蛋白抗原性及表面抗原位點進行分析，并與中國C株E2蛋白的抗原性進行比較分析，結果表明，F(xiàn)J－1株E2蛋白的抗原表位可能發(fā)生了漂移，如圖4箭頭所示。

圖4 FJ－1株與C株E2蛋白抗原性和抗原表位的變異分析Fig.4 Variation analysis of antigenicity and antigenic epitopes of E2proteins of FJ－1strain and Chinese C strain

3 討論

E2蛋白是CSFV的主要保護性抗原，參與病毒的感染過程，并刺激中和抗體的產(chǎn)生。CSFV E2基因既是一個最主要的免疫基因，也是一個關鍵的毒力基因［11－12］。在 CSFV 基因組中，E2基因的變異最大［12］。因此，分析流行毒株的E2基因，了解其抗原變異性，對研究CSFV多樣性及其分子進化具有重要意義，有助于從分子水平揭示豬瘟免疫接種失敗的原因。

本試驗將CSFV FJ－1株的E2基因與標準毒株、國內(nèi)部分分離株的核苷酸序列進行同源性分析。結果表明，該毒株與中國C株、HCLV株的同源性為94.2%、94.4%；與 Shimen 株 的 同 源 性 為91.5%；與Breseia標準參考株的同源性為90.7%；與Alfort／187、Alfort A19標準參考株的同源性均為92.3%，與國內(nèi)Jiangxi、Guangxi、GZ2009、GXBH 分離株的同源性為 81%、93.1%、91.8%、98.1%；與GXBH 分離株的同源性最高，為98.1%。說明國內(nèi)CSFV在分子流行病學上的分布呈多樣性。雖然FJ－1株與中國使用的C株疫苗毒核苷酸同源性很高，但是遺傳進化樹分析表明FJ－1株在核苷酸水平上與C株存在一定的差異，處在一個獨立的小分支上，這表明現(xiàn)行的豬瘟疫苗在一定程度雖然可以起到保護作用，但是FJ－1株正在向遠離疫苗株的方向變異，這可能是導致福建省部分豬場豬瘟疫苗免疫失敗重要原因。

E2基因為CSFV主要保護性抗原，可分為A、B、C、D 4個結構域，位于E2N端690位～866位氨基酸（aa），A 區(qū) （766aa～866aa），可分為 A1、A2和A3 3個亞區(qū)，其中A1亞區(qū)能誘導機體產(chǎn)生中和抗體；B 區(qū) （691aa～773aa）和 C 區(qū) （691aa～800aa）為非保守區(qū)，是誘導機體產(chǎn)生中和抗體的主要部位；D區(qū)（766aa～800aa）不誘導產(chǎn)生中和抗體［5，14－18］。因此，E2 主 要 的 氨 基 酸 突 變 位 點 區(qū) 域（B、C區(qū)）某些氨基酸殘基的改變可能導致毒株的抗原性發(fā)生變異［17］。結果顯示，F(xiàn)J－1株E2蛋白抗原結構與C－株沒有很大差異。Van Rijn P A等［15］發(fā)現(xiàn)在B、C區(qū)域中的9處（705、710a、713、729、734、833、834、837、858aa）氨基酸的變異能影響抗原決定簇的保守性和特異單抗的產(chǎn)生。而FJ－1毒株主要抗原區(qū)（690aa～866aa）與C－株之間存在22個氨基酸的差異，由C－株到FJ－1野毒株的氨基酸變異分別是705（N→K）、713（A→V）、714（I→T）、715（R→Q）、768（P→S）、796（E→G）、834（Y→H）、837（P→L）、838（E→K）、843（P→L）、845（P→K）、850（T→A）、852（N→S）、856（G→V）、857（P→L）、858（L→S）、859（R→G）、861（V→F）、862（W→L）、865（V→L）、866（P→L）。與Van Rijn P A等［15］的研究相比，在705、713、834、837、858位有相同的變異，而在對A區(qū)抗原決定簇的保守區(qū)和對特異性單抗反應起決定作用的705、710、833、834位氨基酸，在705、834位氨基酸有相同的變異。結果說明FJ－1株E2蛋白的抗原表位與中國C株相比發(fā)生了漂移，這可能是近年來導致福建省豬瘟疫苗免疫失敗的主要原因之一。

FJ－1株與C－株在主要抗原區(qū)的部分氨基酸發(fā)生了突變，該差異是否是導致豬瘟病毒變異的主要原因及是否會影響兔化弱毒疫苗對流行野毒株的免疫保護效果等都還需要進一步的研究。此外，本試驗對E2基因全長進行了遺傳變異分析，不僅補充了CSFV E2基因的分子生物學資料庫，而且為分析流行毒株之間的親緣關系，明確福建目前流行毒株的遺傳進化及豬瘟防控與凈化提供了理論依據(jù)。

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