曾婷婷，謝芝勛，謝麗基，劉加波，龐耀珊，范 晴，羅思思，鄧顯文，謝志勤

（廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所廣西畜禽疫苗新技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西南寧530001）

網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥病毒（Reticuloendotheliosis virus，REV）不僅引起禽類發(fā)生腫瘤，雛禽感染后還能導(dǎo)致后期免疫抑制［1］。目前可以通過病毒分離物免疫熒光［2］、組織病理學(xué)、免疫組化、PCR［3］等方法進(jìn)行診斷，但以上方法需要較長的周期或較昂貴的儀器才能完成。Notomi T等［4］建立的環(huán)介導(dǎo)等 溫 擴(kuò) 增 技 術(shù) （loop－mediated isotheral amplification，LAMP）具有成本低廉、反應(yīng)快速、操作簡便和結(jié)果可視化等優(yōu)點(diǎn)，目前已經(jīng)廣泛應(yīng)用于畜禽傳染病的 診 斷 中［5－7］。 本 試 驗(yàn) 參 考 Yang J等［8］的 方 法，先設(shè)計(jì)一套針對REV的LAMP引物，在此基礎(chǔ)上加入一條加速引物，以期提高LMAP法檢測REV的敏感性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病毒樣品 網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥病毒前病毒DNA、J亞群禽白血病病毒前病毒DNA、雞馬立克病病毒DNA、雞傳染性貧血病毒DNA、傳染性法氏囊病病毒cDNA和禽呼腸病毒cDNA由本實(shí)驗(yàn)室保存；A亞群禽白血病病毒（RAV－1株）、B亞群禽白血病病毒（RAV－2株）購自中國獸醫(yī)微生物菌種保藏中心。

1.1.2 試劑 Bst DNA 聚合酶（大片段）、MgSO4、甜菜堿為New England Biolabs公司產(chǎn)品；PCR試劑為北京全式金生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；海洋動(dòng)物組織基因組抽提試劑盒為廣州東盛生物科技有限公司產(chǎn)品；dNTPs為寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品；鈣黃綠素、MnCl2為International Laboratory USA產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 LAMP引物設(shè)計(jì) 根據(jù)GenBank中網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥病毒gp90基因保守區(qū)段，使用在線軟件Primer Explorer V4（http：／／primerexplorer.jp／e／v4－manual／index.html）設(shè)計(jì) LAMP 引物。引物由廣州Invitrogen公司合成。再在兩條環(huán)引物中間設(shè)一條加速引物（accelerating primer，AP），用 Oligo 6.0驗(yàn)證與其他幾條引物之間不能形成緊密的二聚體結(jié)構(gòu)。引物序列見表1。

1.2.2 LAMP反應(yīng)條件優(yōu)化 25μL LAMP反應(yīng)體系：1μL ～4μL dNTPs（10mmol／L），2.5μL 10×Bst buffer，1μL Bst DNA聚合酶8U，4μL ～7μL甜菜堿 Betaine（5mmol／L），2μL ～9μL MgSO4（25mmol／L），1μL 引物 （FIP 40μmol／L，BIP 40μmol／L，LF 20μmol／L，LB 20μmol／L，B3 5μmol／L，F(xiàn)3 5μmol／L），1μL 鈣黃綠素 Calcein（625μmol／L），1μL MnCl2（12.5mmol／L）和1μL模板（網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥病毒前病毒的基因組DNA），加純凈水至25μL。改良型LAMP在此基礎(chǔ)上加入20μmol／L AP。反應(yīng)條件：溫度按60、61、62、63、64、65、66、67 ℃依次遞增反應(yīng)50min，80℃作用5min滅活。分別按照上述反應(yīng)體系和反應(yīng)條件進(jìn)行摸索，獲得最佳反應(yīng)體系和條件。

表1 LAMP引物序列Table 1 The primer sequences of LAMP

1.2.3 特異性試驗(yàn) 分別以網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥病毒前病毒DNA，A、B、J亞群禽白血病毒前病毒DNA，馬立克病病毒DNA，雞傳染性貧血病毒DNA，傳染性法氏囊病毒cDNA和禽呼腸病毒cDNA為模板，按照最佳反應(yīng)體系和最佳反應(yīng)條件進(jìn)行LAMP反應(yīng)。

1.2.4 敏感性試驗(yàn) 將網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥病毒的DNA10倍稀釋，從14ng／μL到1.4fg／μL為模板，按照1.2.2的最佳反應(yīng)體系和最佳反應(yīng)條件進(jìn)行LAMP反應(yīng)。為比較加入加速引物前后的敏感性，再將14fg／μL 2倍稀釋至7fg／μL，進(jìn)行LAMP反應(yīng)。

同時(shí)以常規(guī)PCR作為對照，以同樣的模板濃度進(jìn)行常規(guī)的PCR擴(kuò)增（常規(guī)的PCR擴(kuò)增引物［9］F：CAGGAATTCAAGAATGGACTGTCTCACC，R：ATT GTC GACCTGGTGGAGGACATAGC，目的片段約為1 100bp）。

1.2.5 病料檢測 抽提16份臨床上疑為腫瘤病或其他免疫抑制性疾病的雞內(nèi)臟組織的DNA，用于LAMP檢測，同時(shí)與普通PCR檢測比較其陽性率。

2 結(jié)果

2.1 反應(yīng)條件優(yōu)化結(jié)果

25μL LAMP反應(yīng)體系：2μL dNTPs，2.5μL 10×Bst buffer，1μL Bst DNA聚合酶8U，5μL甜菜堿Betaine，3μL MgSO4，1μL引物，1μL鈣黃綠素 Calcein，1μL MnCl2，1μL模板 DNA，加水至25μL。最佳反應(yīng)條件為64℃反應(yīng)50min，80℃作用5min滅活。

判斷標(biāo)準(zhǔn)：若反應(yīng)產(chǎn)物顏色變?yōu)榫G色，為陽性反應(yīng)；若顏色為棕紅色，為陰性反應(yīng)。

2.2 特異性試驗(yàn)結(jié)果

從圖1和圖2可以看出，只有網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥病毒檢測為陽性結(jié)果（肉眼觀察可見翠綠色，瓊脂糖凝膠電泳呈現(xiàn)典型的連續(xù)梯狀條帶），而對A、B、J亞群禽白血病毒，馬立克病病毒，雞傳染性貧血病毒，傳染性法氏囊病病毒和呼腸病毒均為陰性（肉眼觀察可見棕紅色，電泳均沒有特征性梯形條帶出現(xiàn)）。

圖1 LAMP特異性試驗(yàn)APFig.1 Specificity test of AP－LAMP

圖2 特異性試驗(yàn)LAMP產(chǎn)物電泳結(jié)果Fig.2 Electrophoresis of specific LAMP products

2.3 敏感性試驗(yàn)結(jié)果

圖3為肉眼觀察結(jié)果，圖4為電泳檢測結(jié)果?？梢钥闯?，LAMP對網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥病毒前病毒DNA的最小檢測限為14fg／μL（肉眼觀察可見翠綠色），而改良型LAMP的最小檢測限為7fg／μL，是前者的2倍。

常規(guī)PCR對照組20g／L瓊脂糖凝膠電泳觀察結(jié)果如圖5所示，得到PCR預(yù)期擴(kuò)增片段大小約為1 000bp，常規(guī)PCR方法最小檢測限為1.4pg。本試驗(yàn)建立的改良型LAMP檢測方法敏感性比常規(guī)PCR高200倍。

圖3 AP－LAMP的敏感性試驗(yàn)Fig.3 Sensitivity test of AP－LAMP

圖4 AP－LAMP敏感性試驗(yàn)產(chǎn)物電泳結(jié)果Fig.4 Electrophoresis of sensitivity test products of AP－LAMP

圖5 普通PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果Fig.5 Electrophoresis of PCR products

2.4 病料檢測結(jié)果

16份樣品檢測結(jié)果與普通PCR檢測結(jié)果100%符合，其中5號和10號病料PCR檢測為弱陽性，但改良型LAMP結(jié)果為陽性，說明后者在檢測臨床樣品時(shí)更加敏感（圖6和圖7）。

圖6 AP－LAMP病料檢測結(jié)果Fig.6 Samples detected by AP－LAMP

圖7 病料檢測PCR電泳結(jié)果Fig.7 Electrophoresis of samples detected byPCR

3 討論

網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥病毒（REV）可感染包括雞在內(nèi)的多種禽類，根據(jù)不同毒株可引起急、慢性腫瘤，還能導(dǎo)致長期的免疫抑制。REV可以通過蚊蟲水平傳播，也能低水平的垂直傳播，近年來發(fā)現(xiàn)還有一個(gè)比較重要的傳播途徑就是通過污染活疫苗注射傳播［10］。在養(yǎng)殖企業(yè)，需要及時(shí)將感染的病禽和污染的疫苗檢測出來并剔除。REV屬于反轉(zhuǎn)錄病毒［11］，在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制時(shí)以前病毒DNA的形式存在于細(xì)胞基因組內(nèi)，前病毒DNA也可以插入到馬立克病或禽痘疫苗的病毒基因組內(nèi)。所以在檢測時(shí)，可直接抽提組織或這些疫苗的DNA進(jìn)行檢測。

由于LAMP技術(shù)方便快捷，不需要特殊儀器的優(yōu)點(diǎn)而特別適用于基層單位檢測REV的感染情況，本試驗(yàn)利用實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)建立的LAMP技術(shù)平臺(tái)［12－15］，設(shè)計(jì)一套針對網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥病毒的LAMP引物，在環(huán)引物L(fēng)F和LB之間添加一條加速引物（AP），通過優(yōu)化反應(yīng)條件，建立了改良型網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥病毒可視化LAMP診斷方法。經(jīng)過添加加速引物之后，其敏感性是原來的2倍，是普通PCR的200倍，可以檢測到低至7fg／μL的DNA，這在檢測疫苗的污染情況時(shí)更具優(yōu)勢。而病料檢測試驗(yàn)也表明，改良型LAMP的敏感性更高，在普通PCR結(jié)果顯示為弱陽性的情況下仍能檢測出來。

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