李書光，段笑笑，苗立中，李 峰，沈志強(qiáng)，單 虎

（1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)，山東青島266109；2.山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，山東濱州256600；3.山東省預(yù)防獸醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東青島266109）

病原菌引起的呼吸道疾病嚴(yán)重制約著規(guī)?；B(yǎng)殖場(chǎng)的健康發(fā)展。近年來(lái)，在世界范圍內(nèi)副豬嗜血桿菌引發(fā)保育豬嚴(yán)重的呼吸道疾病，已經(jīng)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失［1］。副豬嗜血桿菌為巴氏桿菌屬的革蘭陰性短小桿菌，能夠在健康豬的鼻黏膜和扁桃體等上呼吸道區(qū)域檢測(cè)到［2］。一些菌株能夠移行至肺部，引起肺炎，進(jìn)而引起全身性疾病，表現(xiàn)為特征性的纖維素性漿膜炎、關(guān)節(jié)炎、腦膜炎等，被稱為Gl?sser＇s病［3］。國(guó)內(nèi)外使用瓊擴(kuò)法將副豬嗜血桿菌分為15個(gè)血清型，但是目前仍有較大數(shù)量的分離菌株不能夠用瓊擴(kuò)法進(jìn)行分型；利用ERIC－PCR技術(shù)，15個(gè)參考菌株表現(xiàn)為唯一獨(dú)特的指紋圖譜，對(duì)分離株的分型率可以達(dá)到100%［4］。目前研究顯示副豬嗜血桿菌的病原性和血清型之間沒(méi)有必然的聯(lián)系，但是常規(guī)的劃分方法血清型1、5、10、12、13、14為高毒力菌株，2、4、15為中等毒力菌株，3、6、7、8、9、11為無(wú)毒力株［5］。研究者一致認(rèn)為，長(zhǎng)途運(yùn)輸、環(huán)境的突變、斷奶等一些應(yīng)激能夠引起副豬嗜血桿菌病的暴發(fā)，特別是在帶有強(qiáng)毒力菌株的豬群［6］。

大多數(shù)的豬群都有副豬嗜血桿菌的隱性感染，因此豬群會(huì)有一定的免疫保護(hù)力，用該豬群進(jìn)行全身感染的病例復(fù)制是不可能實(shí)現(xiàn)的，通過(guò)剖腹產(chǎn)不吃初乳或者順產(chǎn)不吃初乳的仔豬可以成功地復(fù)制副豬嗜血桿菌病例［7］。目前防控該病的傳統(tǒng)方法為使用商品疫苗或者自家苗，疫苗對(duì)同種血清型的細(xì)菌侵染具有很好的保護(hù)力。

1 材料與方法

1.1 材料

疑似副豬嗜血桿菌病料采自河南新鄉(xiāng)；胰大豆瓊脂（TSA和TSB）培養(yǎng)基為美國(guó)BD公司產(chǎn)品；HPS2型、5型、7型標(biāo)準(zhǔn)血清由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)惠贈(zèng)；芬蘭Bioscreen全自動(dòng)微生物生長(zhǎng)曲線測(cè)定儀為上海謂載商貿(mào)發(fā)展有限公司產(chǎn)品；煙酰胺腺嘌呤二核苷 酸 （nicotinamide adenine dinucleotide，NAD，NAD）為上海生物工程公司產(chǎn)品；牛血清為浙江天杭生物科技有限公司產(chǎn)品；馬血清和豬血清均為蘭州民海生物工程有限公司產(chǎn)品；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純；豚鼠為北京實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 分離株的分離及PCR鑒定 將病料的心包積液、關(guān)節(jié)液和腦組織等勻漿劃線接種于含NAD的TSA培養(yǎng)基上，37℃厭氧罐中初代培養(yǎng)48h后觀察細(xì)菌生長(zhǎng)情況，挑取疑似單個(gè)菌落，進(jìn)行純培養(yǎng)，革蘭染色鏡檢，并使用上游引物 HPS1：GTGATGAGGAAGGGTGGTGT，下游引物 HPS2：GGCTTCGTCACCCTCTGT進(jìn)行PCR鑒定。1.2.2 分離株培養(yǎng)特性

1.2.2.1 3種有機(jī)氮源對(duì)HPS生長(zhǎng)的影響 加入50mg／L NAD未加入胰蛋白胨的TSB培養(yǎng)基，以0、8、17、26g／L等4個(gè)梯度分別加入胰蛋白胨、蛋白胨和酵母浸粉3種不同的有機(jī)氮源混勻，取380μL加入培養(yǎng)板中，設(shè)置3個(gè)重復(fù)，接種副豬嗜血桿菌18hTSB培養(yǎng)物20μL，將培養(yǎng)板放入全自動(dòng)微生物生長(zhǎng)曲線測(cè)定儀中進(jìn)行培養(yǎng)、監(jiān)測(cè)。

1.2.2.2 2種無(wú)機(jī)氮源對(duì)HPS生長(zhǎng)的影響 加入50mg／L NAD的TSB培養(yǎng)基，以2、4、6、8g／L等4個(gè)梯度分別加入硫酸銨和氯化銨2種不同無(wú)機(jī)氮源混勻，取380μL加入培養(yǎng)板中，設(shè)置3個(gè)重復(fù)，接種副豬嗜血桿菌18hTSB培養(yǎng)物20μL，將培養(yǎng)板放入全自動(dòng)微生物生長(zhǎng)曲線測(cè)定儀中進(jìn)行培養(yǎng)、監(jiān)測(cè)。

1.2.2.3 不同的碳源對(duì) HPS生長(zhǎng)的影響 加入50mg／L NAD未添加葡萄糖的TSB培養(yǎng)基，以0、1、2.5、5g／L等4個(gè)梯度分別加入葡萄糖、乳糖和麥芽糖3種不同的碳源混勻，取380μL加入培養(yǎng)板中，設(shè)置3個(gè)重復(fù)，接種副豬嗜血桿菌18hTSB培養(yǎng)物20μL，將培養(yǎng)板放入全自動(dòng)微生物生長(zhǎng)曲線測(cè)定儀中進(jìn)行培養(yǎng)、監(jiān)測(cè)。

1.2.2.4 不同的動(dòng)物來(lái)源血清對(duì)HPS生長(zhǎng)的影響

加入50mg／L NAD的 TSB培養(yǎng)基，以0、10、25、50mL／L等4個(gè)梯度分別加入牛血清、馬血清和豬血清3種不同的碳源混勻，取380μL加入培養(yǎng)板中，設(shè)置3個(gè)重復(fù)，接種副豬嗜血桿菌18hTSB培養(yǎng)物20μL，將培養(yǎng)板放入全自動(dòng)微生物生長(zhǎng)曲線測(cè)定儀中進(jìn)行培養(yǎng)、監(jiān)測(cè)。

1.2.2.5 不同濃度的NAD對(duì)HPS生長(zhǎng)的影響未加入 NAD的 TSB培養(yǎng)基，以0、25、50、75mg／L 4個(gè)梯度加入NAD混勻，取380μL加入培養(yǎng)板中，設(shè)置3個(gè)重復(fù)，接種副豬嗜血桿菌18hTSB培養(yǎng)物20μL（50mg／L的NAD含量），將培養(yǎng)板放入全自動(dòng)微生物生長(zhǎng)曲線測(cè)定儀中進(jìn)行培養(yǎng)、監(jiān)測(cè)。

1.2.3 分離株對(duì)豚鼠致病性及藥物敏感性分析用8只豚鼠，隨機(jī)分為3組，試驗(yàn)1組3只，試驗(yàn)2組3只，對(duì)照組2只。試驗(yàn)1組每只豚鼠腹腔注射1mL 1.0×108cfu／mL HPS，試驗(yàn)2組每只豚鼠注射1mL 1.0×109cfu／mL的HPS，對(duì)照組每只豚鼠注射1mLTSB，連續(xù)觀察7d。期間死亡的豚鼠剖檢觀察，并作細(xì)菌分離和PCR檢測(cè)。7d后處死存活的豚鼠和對(duì)照組，觀察臨床病理變化，分離病原。

無(wú)菌放置干燥抗菌藥物紙片緊貼于密集劃線接種了菌種的培養(yǎng)基表面，每個(gè)直徑90mm的平皿貼7個(gè)藥敏紙片、蓋上平皿，倒置平皿置37℃溫箱培養(yǎng)24h，取出測(cè)量觀察結(jié)果，判斷標(biāo)準(zhǔn)按2010版CLSI M100－S20執(zhí)行。

2 結(jié)果

2.1 病原菌的分離及PCR檢測(cè)

分離到的病原菌在添加NAD的TSA培養(yǎng)基生長(zhǎng)48h后呈光滑、無(wú)色透明、露珠狀、扁平的、直徑1mm小菌落。革蘭染色陰性，多呈短桿狀、有的呈球桿狀（圖1）。純化后的細(xì)菌，使用副豬嗜血桿菌檢測(cè)引物進(jìn)行PCR鑒定，獲得800bp左右的片段（圖2）

圖1 分離菌的革蘭染色鏡檢（1 000×）Fig.1 The bacterial isolate by Gram strain（1 000×）

圖2 副豬嗜血桿菌PCR鑒定結(jié)果Fig.2 PCR identification of HPS

2.2 病原菌的培養(yǎng)特性

2.2.1 有機(jī)氮源 胰蛋白胨、蛋白胨和酵母浸粉以0、8、17、26g／L等4個(gè)梯度加入未加胰蛋白胨的TSB培養(yǎng)基中，接種后在全自動(dòng)微生物曲線測(cè)定儀上培養(yǎng)檢測(cè)18h的試驗(yàn)結(jié)果分別見(jiàn)圖3；從圖3中可以看出以蛋白胨26g／L組生長(zhǎng)效果最好，酵母浸粉26g／L組次之。

2.2.2 無(wú)機(jī)氮源 氯化銨和硫酸銨分別按照2、4、6、8g／L等4個(gè)梯度加入添加入TSB培養(yǎng)基中，接種后在全自動(dòng)微生物曲線測(cè)定儀上培養(yǎng)檢測(cè)18h的試驗(yàn)結(jié)果分別見(jiàn)圖4；從圖4中可以看出硫酸銨2g／L組效果最好，且較之未作任何添加物的胰蛋白胨17g／L組有明顯的提升作用。

圖3 有機(jī)氮源濃度篩選Fig.3 The screening of organic nitrogen concentration

圖4 無(wú)機(jī)氮源濃度篩選Fig.4 The screening of inorganic nitrogen source concentration

2.2.3 碳源 加入NAD的未添加葡萄糖的TSB培養(yǎng)基，以0、1、2.5、5g／L等4個(gè)梯度分別加入葡萄糖、乳糖和麥芽糖3種不同的碳源混勻，接種后全自動(dòng)微生物生長(zhǎng)曲線測(cè)定儀中進(jìn)行培養(yǎng)、監(jiān)測(cè)，結(jié)果見(jiàn)圖5。圖5中可以看出以麥芽糖2.5g／L組效果最好。

2.2.4 血清 加入NAD的TSB培養(yǎng)基，以0、10、25、50mL／L等4個(gè)梯度分別加入牛血清、馬血清和豬血清，全自動(dòng)微生物生長(zhǎng)曲線測(cè)定儀中進(jìn)行培養(yǎng)、監(jiān)測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖6。圖6中可以看出3種血清的添加量均對(duì)該菌株的生長(zhǎng)有影響，且3種血清中以50mL／L組效果均較好。

2.2.5 不同濃度的NAD對(duì)HPS生長(zhǎng)的影響 未加入 NAD的 TSB培養(yǎng)基，以0、25、50、75mg／L 4個(gè)梯度加入NAD混勻，全自動(dòng)微生物生長(zhǎng)曲線測(cè)定儀中進(jìn)行培養(yǎng)、監(jiān)測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖7。因種子液中的NAD含量為50mg／L，4個(gè)梯度實(shí)際含量為2.5、27.5、52.5、77.5mg／L。圖7中可以看出，NAD實(shí)際添加量為27.5mg／L的效果最好，高濃度的反而生長(zhǎng)不好。

2.3 豚鼠致病性及藥物敏感試驗(yàn)

試驗(yàn)1組3只豚鼠在攻毒后出現(xiàn)高度的精神不振，1周內(nèi)未發(fā)生死亡；試驗(yàn)2組3只豚鼠在攻毒后第1天死亡2只，第2天死亡1只，死亡的豚鼠肝臟能夠分離到副豬嗜血桿菌；對(duì)照組無(wú)任何癥狀。對(duì)死亡豚鼠剖檢，可以觀察到肺臟有明顯的出血點(diǎn)，但是無(wú)其他特征性的病變；1周后處死試驗(yàn)1組和對(duì)照組的豚鼠，剖檢結(jié)果顯示，對(duì)照組無(wú)任何病變；試驗(yàn)1組，肺臟有彌漫性出血點(diǎn)，并有實(shí)變和腫脹，肝臟腫脹、充血，但均未見(jiàn)漿膜炎癥狀。

藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示，阿奇霉素為低敏感度藥物，頭孢曲松為高敏感度藥物，其他藥物為敏感藥物（表1）。

3 討論

圖5 碳源濃度篩選Fig.5 The screening of carbon source concentration

圖6 最佳血清濃度篩選Fig.6 The screening of optimal serum concentrations

副豬嗜血桿菌的血清學(xué)分布具有一定的地域性，據(jù)報(bào)道中國(guó)南部地區(qū)，血清5型和4型是主要的流行血清型，其比例為23%和17%；血清2型（8%）、15型（7%），13 型（6%）和12 型（5%）都占一定的比例；另外有20%的菌株無(wú)法分型［8］。在針對(duì)副豬嗜血桿菌毒力基因的研究中，capD基因編碼多糖生物合成蛋白，在試驗(yàn)中證實(shí)其為一種新發(fā)現(xiàn)的毒力決定基因，該基因的存在與否一定程度上決定了副豬嗜血桿菌的毒力和血清抵抗力，可以作為鑒別副豬嗜血桿菌毒力的標(biāo)記［9］。國(guó)內(nèi)外開(kāi)展了針對(duì)副豬嗜血桿菌多種檢測(cè)方法的研究工作，LAMP檢測(cè)方法的建立使該病原的檢測(cè)更加便捷［10］。在亞單位疫苗的研發(fā)中，研究證實(shí)外膜蛋白（OMPs）rGAPDH、rOapA、rHPS－0675能夠誘導(dǎo)針對(duì)副豬嗜血桿菌SH0165的免疫保護(hù)；NPAPT作為免疫抗原的免疫保護(hù)作用也有報(bào)道；副豬嗜血桿菌具有巴氏桿菌屬致病菌的抗吞噬作用，借助高致病性副豬嗜血桿菌基因文庫(kù)的構(gòu)建和肺巨噬細(xì)胞的互作，篩選到了VtaA8和VtaA9兩個(gè)具有抗吞噬作用的表面蛋白［11］；主要外膜蛋白（OMP）的可溶性產(chǎn)物能夠誘導(dǎo)模型動(dòng)物產(chǎn)生抵抗副豬嗜血桿菌感染的保護(hù)力［12］；這些研究工作均有助于副豬嗜血桿菌的科學(xué)防控和新的候選疫苗研究開(kāi)發(fā)工作。

圖7 NAD最佳工作濃度篩選Fig.7 The screening of optimal NAD work concentration

表1 藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果Table 1 Drug susceptibility test results

本研究中，探討了單因素對(duì)該菌株的培養(yǎng)特性的影響。NAD添加試驗(yàn)中，未添加NAD組生長(zhǎng)也較好，可能是由于種子培養(yǎng)基中NAD含量過(guò)高（50mg／L），接種的培養(yǎng)基中殘留的NAD能夠促使其生長(zhǎng)，本試驗(yàn)中篩選到的較好的NAD含量經(jīng)換算可知為27.5mg／L。預(yù)設(shè)添加NAD的培養(yǎng)基中，探討培養(yǎng)基中3種血清的濃度對(duì)HPS生長(zhǎng)的影響，結(jié)果表明，3種血清對(duì)HPS的生長(zhǎng)有促進(jìn)作用，且較高濃度OD 600nm值均達(dá)到0.57以上；氮源選擇方面，蛋白胨高濃度的試驗(yàn)效果最好，硫酸銨2g／L的添加對(duì)該菌株的生長(zhǎng)具有較好的促進(jìn)作用；碳源以2.5g／L的添加量效果最好。

前期研究中，王大鵬等［13］采用3周齡～4周齡HPS陰性健康仔豬作為試驗(yàn)用動(dòng)物，攻毒后使仔豬出現(xiàn)食欲下降，體溫升高，皮下出血，被毛粗亂，關(guān)節(jié)腫脹，跛行等臨床癥狀；但是由于母源抗體的影響，只有少數(shù)未吃初乳的仔豬可以用作動(dòng)物模型。該分離株對(duì)豚鼠具有一定的致病性，在下一步的疫苗研制中，對(duì)后續(xù)的動(dòng)物模型建立具有重要的參考價(jià)值。

［1］ 耿萬(wàn)友，付作寬，周 霞，等.副豬嗜血桿菌病研究進(jìn)展［J］.動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2012，33（12）：161－164.

［2］ 李淑芳，張培君，龔玉梅，等.副豬嗜血桿菌轉(zhuǎn)鐵結(jié)合蛋白研究進(jìn)展［J］.動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2012，33（8）：77－80.

［3］ Pina S，Olvera A，Barceló A，et al.Trimeric autotransporters ofHaemophilusparasuis：generation of an extensive passenger domain repertoire specific for pathogenic strains［J］.Bacteriol J，2009，191：576－587.

［4］ 萬(wàn)世平，王 建，葛菲菲，等.副豬嗜血桿菌上海分離株的生物學(xué)特性與基因型分析［J］.畜牧與獸醫(yī)，2010，42（4）：65－68.

［5］ Oliveira S，Pijoan C.Haemophilusparasuis：new trends on diagnosis，epidemiology and control［J］.Vet Microbiol，2004，99：1－12.

［6］ Nedbalcova K，Satran P，Aglic Z.Haemophilus parasuis and Glasser＇s disease in pigs：a review［J］.Vet Med，2006，51：168－179.

［7］ Oliveira S，Galina L，Blanco I，et al.Naturally farrowed，artificially reared pigs as an alternative model for experimental infection by Haemophilus parasuis［J］.Can J Vet Res，2003，67：146－150.

［8］ Zhang J，Xu C，Guo L，et al.Prevalence and characterization of genotypic diversity of Haemophilus parasuis isolates from southern China［J］.J Vet Res，2012，76（3）：224－229.

［9］ Wang X，Xu X，Wu Y，et al.Polysaccharide biosynthesis protein CapD is a novel pathogenicity－associated determinant of Haemophilus parasuis involved in serum－resistance ability［J］.Vet Microbiol，2013，2（5）：S0378－1135.

［10］ Zhang J M，Shen H Y，Liao M，et al.Detection of Haemophilus parasuis isolates from South China by loop－mediated isothermal amplification and isolate characterization［J］.J Vet Res，2012，4（24）：E1－6.doi：10.4102／ojvr.v79i1.383.

［11］ Costa－Hurtado M，Ballester M，Galofré－MilàN，et al.VtaA8 and VtaA9from Haemophilus parasuis delay phagocytosis by alveolar macrophages［J］.Vet Res，2012，43（1）：57.

［12］ Ahn J，Hong M，Yoo S，et al.Soluble expression of OmpA from Haemophilus parasuis in Escherichia coli and its protective effects in the mouse model of infection［J］.J Microbiol Biotechnol，2012，22（9）：1307－1309.

［13］ 王大鵬，吳家強(qiáng)，于 江，等.副豬嗜血桿菌血清5型分離株生長(zhǎng)曲線與致病力研究［J］.西南農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2011，24（5）：1972－1976.