嚴(yán)專(zhuān)強(qiáng)，劉 迪，，劉佳佳，覃健萍，魯俊鵬，謝青梅，畢英佐，陳 峰＊

（1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，廣東廣州510642；2.廣東溫氏食品集團(tuán)股份有限公司，廣東云浮527439）

雞傳染性法氏囊?。↖nfectious bursal disease，IBD）是由傳染性法氏囊病病毒（Infectious bursal disease virus，IBDV）引起的幼雞的一種急性高度接觸性傳染病。IBDV的基因組由A、B兩個(gè)片段的雙鏈 RNA組成［1－2］。A片段長(zhǎng)約3.2kb，含有2個(gè)部分重疊并且大小不等的開(kāi)放性閱讀框（open reading frame，ORF）［3］。小 ORF編碼非結(jié)構(gòu)蛋白 VP5（17 ku），大ORF編碼多聚蛋白NH2－pVP2－VP4－VP3－COOH（110ku）；B片段長(zhǎng)約2 827bp，只編碼 VP1蛋白，具 有 RNA 依 賴 的 RNA 聚 合 酶 的 功 能［4－5］。在IBDV的結(jié)構(gòu)蛋白中，VP2和VP3是組成病毒核衣殼的主要蛋白成分，約占病毒蛋白成分的51%和40%［6］。VP2是IBDV的主要衣殼蛋白，它含有1個(gè)高變區(qū)（206aa～350aa），包含2個(gè)親水氨基酸區(qū)，即第1親水區(qū) （2124aa～224aa）和第2親水區(qū)（314aa～324aa），2個(gè)親水區(qū)的氨基酸變化被認(rèn)為是抗原變異的主要因素［7］。VP2蛋白還是主要的保護(hù)性抗原，其誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生毒株特異性中和抗體能被動(dòng)地保護(hù)宿主免受IBDV的感染［8］。

根據(jù)致病型和病毒中和試驗(yàn)可將血清I型IBDV分為經(jīng)典毒株（classical IBDV，cIBDV）、變異株（variant IBDV，vIBDV）和超強(qiáng)毒株（very virulent IBDV，vvIBDV）。目前，臨床上存在著超強(qiáng)毒株、經(jīng)典毒株和變異株等各種致病型病毒株的流行，其危害主要表現(xiàn)為：一是IBDV感染導(dǎo)致雞群生產(chǎn)力下降或死亡，造成直接經(jīng)濟(jì)損失；二是感染IBDV可導(dǎo)致雞群免疫抑制，致使機(jī)體免疫應(yīng)答水平下降，增加并發(fā)或繼發(fā)感染其他疾病的機(jī)會(huì)，引起雞廣泛的臨床發(fā)病和死亡而帶來(lái)經(jīng)濟(jì)損失［9］。鑒于上述原因，本研究對(duì)2011年4月～8月分離于四川主要養(yǎng)禽地區(qū)的10株雞傳染性法氏囊病病毒進(jìn)行VP2基因的克隆測(cè)序，旨在從分子水平探索四川地區(qū)IBDV的流行特點(diǎn)，及時(shí)了解病毒的變異情況，為研究近年來(lái)出現(xiàn)的免疫失敗和IBD的有效防控奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 毒株、菌種和克隆載體 本研究所選取的毒株均分離自四川德陽(yáng)、眉山等地區(qū)的養(yǎng)雞場(chǎng)，分別命名 為 DXH－201104、LDP－201104、LFL－201106、LKL－201106、 LKM－201106、 WT－201106、 XN－201106、ZHW－201107、ZLC－201107、ZW－201107；DH5α感受態(tài)細(xì)胞為天根生化科技有限公司產(chǎn)品；pMD19－T Simple載體為寶生物工程（（大連）有限公司產(chǎn)品。

1.1.2 主要試劑 AxyPrep體液病毒DNA／RNA小量試劑盒，DNA片段快速純化／回收試劑盒為愛(ài)思進(jìn)生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；一步法RT－PCR試劑盒（PrimeScript○ROne Step RT－PCR Kit Ver.2），Ex Taq DNA 聚 合 酶 （5U／μL），DNA Marker DL 2 000均為寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 引物合成 參照文獻(xiàn)［10］公布的引物序列合 成 引 物。IBDs 5′－GCCGATGATTACCAAT－TCTCATC－3′，IBDa 5′－CCGGATTATGTCTTTGAAGC－3′，預(yù)期擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為717bp，引物由奧科生物技術(shù)有限責(zé)任公司合成。

1.2.2 病毒核酸提取 病毒RNA提取根據(jù)愛(ài)思進(jìn)生物技術(shù)（杭州）有限公司AxyPrep體液病毒DNA／RNA小量試劑盒的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.2.3 RT－PCR擴(kuò)增病毒VP2基因 反轉(zhuǎn)錄參照一步法RT－PCR試劑盒采用25μL體系，RT－PCR反應(yīng)條件為：50℃反轉(zhuǎn)錄30min；94℃5min；94℃40s、56℃40s、72℃40s，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min，4℃終止反應(yīng)。擴(kuò)增產(chǎn)物用10g／L瓊脂糖電泳檢測(cè)，并用凝膠成像系統(tǒng)對(duì)電泳結(jié)果成像。

1.2.4 RT－PCR產(chǎn)物的純化與克隆測(cè)序 PCR產(chǎn)物純化回收按Axygen公司的膠純化試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，回收后產(chǎn)物與pMD19－T Simple載體混合離心后于16℃條件下連接過(guò)夜；將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸埃希菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂布于含氨芐西林的LB固體培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)過(guò)夜，挑選抗性菌落擴(kuò)大培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，用PCR進(jìn)行鑒定，樣品由奧科生物技術(shù)有限責(zé)任公司測(cè)序。

1.2.5 序列分析與遺傳進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建 用DNA Star對(duì)分離株與GenBank中登錄的24株參考毒株VP2基因核苷酸序列及其推導(dǎo)的氨基酸序列進(jìn)行同源性比較分析。應(yīng)用ClustalX計(jì)算方法進(jìn)行序列比對(duì)，使用 MEGA4.1的鄰位相接法（Neighbor－joining法）進(jìn)行進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建，并用Bootstrap對(duì)進(jìn)化樹(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)驗(yàn)證。參考毒株及其GenBank登錄號(hào)如下：歐洲超強(qiáng)毒株UK661（NC004178），日本超強(qiáng)毒株OKYM（D49706），中國(guó)香港 超 強(qiáng)毒 株 HK46（AJ878900）；經(jīng) 典 毒 株 CU1（D00867）、52／70（D00869）；標(biāo)準(zhǔn)毒株 CEF94 （AF194428.1）、D78（AF499929.1）、ZJ2000 （AF321056.1）；疫苗株B87（DQ656516）、FW2512（DQ656499）；變異毒株Variant E（AF133904.1）、GLS（AY368653.1）；中國(guó) 內(nèi) 地 分 離 毒 株 GX8／99（AY305386）、YN－h(huán)（EU328335.1）、SH95 （AY134874）、AH2（EU417824.1）、HuN－w（EU328328.1）、HeN－h(huán)（EU328327.1）、HLJ－7（EU042143.1）、HuB－1（EU042145.1）、JS－h(huán) （EU328329.1）、QD－h(huán)（EU328331.1）、ZJ2000 （AF321056.1）、YS07（FJ695138.1）。

2 結(jié)果

2.1 RT－PCR結(jié)果

應(yīng)用合成的引物，以IBDV病毒RNA為模板進(jìn)行RT－PCR擴(kuò)增，電泳后出現(xiàn)一條717bp的目的條帶，與預(yù)期片段大小相符（圖1）。

圖1 IBDV分離株VP2高變區(qū)的RT－PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 RT－PCR amplification of VP2gene of IBDV isolates

2.2 序列特征性氨基酸位點(diǎn)分析

早期研究發(fā)現(xiàn)，通過(guò)部分特征性氨基酸可以區(qū)分不同類(lèi)型的毒株，這些氨基酸分別為超強(qiáng)毒株的222位（A）、256位（I）、294位（I）和299位（S），變異株的249位 （K）、254位（S）和弱毒株的253位（H）、279位（N）、284位（T）和330位（R）［11］。根據(jù)測(cè)定的9個(gè)IBDV分離株的核苷酸序列推導(dǎo)出其氨基酸序列，發(fā)現(xiàn)其毒力相關(guān)位點(diǎn)的特征性氨基酸與此前報(bào)道的超強(qiáng)毒株一致。分離株ZW－201107在254位氨基酸發(fā)生了類(lèi)似變異株的變異，即G變?yōu)镾。其余9個(gè)分離株均未發(fā)生抗原變異株GLS和variant E的249K和254S的變化。與常用疫苗株2512、52－70、B87（in）、Cu－1和 D78相比較，不同分離株在相關(guān)功能區(qū)內(nèi)均有不同程度的氨基酸差別（表1）。

2.3 同源性分析

測(cè)序結(jié)果表明，10株傳染性法氏囊病病毒分離株VP2基因的核苷酸序列長(zhǎng)度均為717bp，編碼239個(gè)氨基酸。10個(gè)分離株與參考株VP2序列通過(guò)MegAlign軟件Clustal W方法進(jìn)行序列比較，分析表明，各個(gè)分離株之間核苷酸序列同源性在95.3%～99.9%之間，其推導(dǎo)氨基酸序列同源性在99.2%～100%之間，與國(guó)內(nèi)其他vvIBDV毒株的核苷酸同源性在94.3%～99.0%之間。本研究10個(gè)分離株與日本分離的超強(qiáng)毒株OKYM、歐洲經(jīng)典強(qiáng)毒株52／70、美國(guó)變異株GLS、標(biāo)準(zhǔn)毒株CEF94和疫苗株B87（in）之間核苷酸和氨基酸的同源性如表2所示。可見(jiàn)，所有分離株與超強(qiáng)毒株的同源性比較高，而與經(jīng)典強(qiáng)毒株、經(jīng)典弱毒株、變異株和疫苗株的同源性較低。

2.4 遺傳進(jìn)化分析

將10個(gè)IBDV分離株的核苷酸序列與參考毒株的相應(yīng)序列用MEGA4.0構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)，進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析。結(jié)果表明，這些毒株共形成2個(gè)大的分支，即超強(qiáng)毒株分支和經(jīng)典毒株，其中超強(qiáng)毒株分為3個(gè)小群，經(jīng)典毒株分為強(qiáng)毒株、變異株、中等毒力疫苗株和弱毒株4個(gè)小的分支（圖2）。10個(gè)分離毒株均處于超強(qiáng)毒株分支，主要集中于2個(gè)大的亞群，LFL－201106、 LKM－201106、 WT－201106、 XN－201106、ZHW－201107和 ZLC－201107等 6個(gè)分離株與香港超強(qiáng)毒株HK46以及國(guó)內(nèi)分離株GX8－99和 AH2處于同一亞群，DXH－201104、LDP－201104和LKL－201106等3個(gè)分離株與歐洲超強(qiáng)毒株UK661以及國(guó)內(nèi)分離株 QD－h(huán)、HuN－w和 YN－h(huán)處于同一亞群，而分離株ZW－201107則單獨(dú)處于一個(gè)小分支。

3 討論

血清Ⅰ型的IBDV遍布全世界，基本所有的家禽主產(chǎn)區(qū)都有IBD發(fā)生。IBDV的感染率很高，絕大部分雞群在幼齡階段都面臨IBDV的感染，要么是自然感染，要么是疫苗接種。傳染性法氏囊病已嚴(yán)重威脅著包括中國(guó)在內(nèi)的世界養(yǎng)雞業(yè)的發(fā)展，盡管各種疫苗在防控傳染性法氏囊病中起到了重要作用，但隨著美國(guó)變異株和歐洲超強(qiáng)毒株的出現(xiàn)，常造成雞群的免疫失敗和經(jīng)濟(jì)損失，現(xiàn)今傳染性法氏囊病仍是養(yǎng)禽業(yè)防控的重要對(duì)象。

本研究對(duì)10株于2011年分離自四川省部分地區(qū)的IBDV毒株的VP2基因進(jìn)行了擴(kuò)增和克隆測(cè)序。結(jié)果表明，擴(kuò)增產(chǎn)物的長(zhǎng)度均由717個(gè)核苷酸組成，編碼239個(gè)氨基酸，與已發(fā)表的血清Ⅰ型IBDV毒株相比較，沒(méi)有發(fā)生堿基的插入和缺失。早期研究發(fā)現(xiàn)，不同IBDV毒株氨基酸差異主要在VP2基因的高變區(qū)（206Y～350T）。VP2具有一個(gè)構(gòu)象依賴（不連續(xù)）的中和抗原決定簇，能刺激機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)性中和抗體，是決定病毒毒力和抗原性的關(guān)鍵區(qū)域，包含2個(gè)親水區(qū)（AA211D～224G，AA314T～324Q）和 1 個(gè) 七 肽 區(qū) S－W－S－A－S－G－S（AA326S～332S），2個(gè)親水區(qū)參與病毒中和性抗原表位的形成，且不同毒株之間具有抗體交叉反應(yīng)，說(shuō)明2個(gè)親水區(qū)的氨基酸序列比較保守［12］。七肽區(qū)與病毒的毒力有關(guān)，該區(qū)域的4個(gè)絲氨酸殘基暴露在VP2蛋白外部，能與細(xì)胞膜形成分子間氫鍵，可能參與了病毒的黏附和成熟過(guò)程［4］。利用相關(guān)軟件對(duì)本研究采用的分離株進(jìn)行分析，結(jié)果表明，10個(gè)分離株中除ZW－201107株254位推導(dǎo)氨基酸為絲氨酸（S）外，其余分離株均具有超強(qiáng)毒株的特征性氨基酸222位（A）、249位（Q）、254位（G）、256位（I）、279位（D）、284（A）、294位（I）和299位（S），且具有富含絲氨酸（S）的七肽區(qū)。序列分析發(fā)現(xiàn)，本研究采用的10個(gè)分離株在第1親水區(qū)和第2親水區(qū)的一些氨基酸位點(diǎn)發(fā)生了與常用疫苗株不同的改變。與52－70株、Cu－1株和D78株相比，10株分離株均在第1親水區(qū)222位有1個(gè)共同的氨基酸突變（P→A）；而與國(guó)內(nèi)常用中等毒力疫苗株B87（in）和FW2512相比，則在第1親水區(qū)222位（L→A），第2親水區(qū)317位（N→S）。IBDV VP2是病毒主要的宿主保護(hù)性抗原，其2個(gè)大親水區(qū)的關(guān)鍵性氨基酸對(duì)于vvIBDV的抗原性至關(guān)重要，其位點(diǎn)的改變可能導(dǎo)致VP2蛋白抗原性發(fā)生改變，上述氨基酸的變化可能是導(dǎo)致目前國(guó)內(nèi)IBD疫苗對(duì)IBDV超強(qiáng)毒株保護(hù)力降低的原因之一。而分離株ZW－201107與標(biāo)準(zhǔn)血清I型相比在抗原關(guān)鍵位點(diǎn)254位氨基酸發(fā)生了類(lèi)似變異株的變異（G→S），這一變化是否會(huì)造成IBDV抗原發(fā)生變異，是否能突破當(dāng)前市售疫苗的保護(hù)，需進(jìn)一步研究。

表1 10個(gè)分離株與參考毒株VP2關(guān)鍵位點(diǎn)的特征性氨基酸比較Table 1 Comparison of the amino acids at critical sites in VP2gene among the 10field isolates and the reference strains

表2 10個(gè)分離株與參考毒株之間vVP2核苷酸和推導(dǎo)氨基酸之間的同源性比較Table 2 Similarty comparsion of the nucleotide sequence and the deduced amino acids of vVP2gene among the 10field isolates and the reference strains

圖2 IBDV VP2基因高變區(qū)進(jìn)化樹(shù)Fig.2 Phylogenetic tree of VP2gene HVR of IBDV

同源性分析結(jié)果表明，所有分離株與國(guó)內(nèi)外分離的超強(qiáng)毒株同源性比較高，而與經(jīng)典強(qiáng)毒株、經(jīng)典弱毒株、變異株和中等毒力疫苗株的同源性均較低；根據(jù)VP2核苷酸序列對(duì)分離株和參考株的遺傳演化進(jìn)行分析表明，所有分離株均與歐洲、亞洲其他國(guó)家以及我國(guó)分離的vvIBDV處于同一亞群，因此認(rèn)為所有的vvIBDV可能來(lái)自一個(gè)共同的祖先；另外，除分離株ZW－201107外，其他毒株均與超強(qiáng)毒株VP2高變區(qū)內(nèi)的氨基酸特點(diǎn)相符合。由此可初步確定目前四川流行的毒株仍以超強(qiáng)毒株為主。

［1］ Jackwood D J，Saif Y M，Hughes J H.Nucleic acid and structural proteins of infectious bursal disease virus isolates belonging to serotypes I and II［J］.Avian Dis，1984，28（4）：990－1006.

［2］ Jeon W J，Choi K S，Lee D W，et al.Molecular epizootiology of infectious bursal disease （IBD）in Korea［J］.Virus Genes，2009，39（3）：342－351.

［3］ 鄂 巍，張改平，羅 俊，等.雞傳染性法氏囊病病毒河南分離株HeYD VP2基因高變區(qū)基因克隆及序列分析［J］.河南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，40（3）：149－153.

［4］ 岳 鋒，寧紅梅，銀 梅，等.雞傳染性法氏囊病病毒XX08株VP2高變區(qū)基因的克隆與序列分析［J］.動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2010，31（3）：35－39.

［5］ Wei Y，Yu X，Zheng J，et al.Reassortant infectious bursal disease virus isolated in China［J］.Virus Res，2008，131（2）：279－282.

［6］ 胡永新，尹燕博，許江濤，等.十一株雞傳染性法氏囊炎病毒VP2全基因序列的特征分析［J］.中國(guó)獸醫(yī)科學(xué)，2011，41（4）：359－366.

［7］ 何秀苗，韋 平，官丁明，等.2000～2007年廣西雞傳染性法氏囊病病毒的分子流行病學(xué)［J］.病毒學(xué)報(bào)，2009，25（6）：437－444.

［8］ Qi X，Gao H，Gao Y，et al.Naturally occurring mutations at residues 253and 284in VP2contribute to the cell tropism and virulence of very virulent infectious bursal disease virus［J］.Antiviral Res，2009，84（3）：225－233.

［9］ 韋 平，丁家波.幾種引起家禽免疫抑制的病毒性疾病及其作用機(jī)理［J］.中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2000，22（4）：316.

［10］ Li Y，Wu T，Cheng X，et al.Molecular characteristic of VP2 gene of infectious bursal disease viruses isolated from a farm in two decades［J］.Virus Genes，2009，38（3）：408－413.

［11］ Ren X，Xue C，Zhang Y，et al.Genomic analysis of one Chinese strain YS07of infectious bursal disease virus reveals unique genetic diversity［J］.Virus Genes，2009，39（2）：246－248.

［12］ Yuwen Y，Gao Y，Gao H，et al.Sequence analysis of the VP2 hypervariable region of eight very virulent infectious bursal disease virus isolates from the northeast of China［J］.Avian Dis，2008，52（2）：284－290.