陶 虹，盧體康，唐金明，廖立珊，阮周曦，劉建利，3，曾少靈，陳 兵，胡運發(fā)，孫 潔，曹琛福，張彩虹，呂建強，楊俊興，花群義，秦智鋒＊

（1.深圳出入境檢驗檢疫局，深圳518045；2.深圳市檢驗檢疫科學(xué)研究院，深圳518001；3.深圳市外來有害生物檢測技術(shù)研發(fā)重點實驗室，深圳518045）

微生物污染是影響我國食品安全最突出的因素之一。由于細菌性疾病對畜禽業(yè)造成的危害日益突出，養(yǎng)殖過程不斷地投喂抗菌藥物來預(yù)防或治療細菌性疾病，隨著抗菌藥的大量使用和廣泛濫用，導(dǎo)致耐藥菌株越來越多［1］，產(chǎn)生β－內(nèi)酰胺酶是革蘭陰性桿菌重要的耐藥機制之一，抗生素的濫用又導(dǎo)致產(chǎn)超廣譜β－內(nèi)酰胺酶（extended－spectrumβ－lactamases，ESBLs）菌株的出現(xiàn)。目前，產(chǎn)ESBLs菌株的流行日益廣泛，且有不斷增加的趨勢。在歐洲，每年約有5 000人死于對抗生素具有耐藥性的細菌感染，而近期德國等多個歐洲國家發(fā)生的耐藥性大腸埃希菌污染食品及食品鏈致人死亡事件，致使歐盟委員會已啟動其“食品與飼料快速警報系統(tǒng)”，以阻止這種致命的大腸埃希菌感染性疾病的蔓延。隨著3代頭孢菌素的廣泛使用，產(chǎn)ESBLs細菌引起的感染越來越多，成為大腸埃希菌對新一代β－內(nèi)酰胺類抗菌藥物耐藥的主要原因。大腸埃希菌是革蘭陰性菌中最易產(chǎn)生耐藥性的細菌［2］，而動物源性耐藥質(zhì)?？赏ㄟ^畜禽產(chǎn)品的加工、食用等過程傳播給人類，給食品安全和臨床治療帶來困難。

目前，從豬肉和禽肉中分離到產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌的報道較多，產(chǎn)ESBLs菌株不僅對青霉素、頭孢菌素類藥物表現(xiàn)出耐藥性，而且對多種抗菌藥都表現(xiàn)出較高的交叉耐藥性和多重耐藥性。根據(jù)其質(zhì)粒編碼的基因和酶底物的不同，ESBLs可分為TEM 型（TEMβ－lactamases）、SHV 型（SHVβ－lactamases）、CTX－M 型（CTX－M β－lactamases）、OXA型（OXAβ－lactamases）及其他型5種基因型，每種基因型又有很多亞型。不同國家和地區(qū)由于使用抗菌藥物的種類和數(shù)量不同，與之相對應(yīng)的ESBLs的基因型也不同［3］。其中，CTX－M 和 TEM 基因型ESBLs最常見，也是目前流行最為廣泛的ESBLs基因型，且經(jīng)常與其他耐藥基因型混合形成“超級細菌”。

2011年德國報道，其超市中1／4的生鮮豬肉含有對多種對抗生素具有耐藥性的細菌，其中主要是CTX－M基因型和TEM基因型。本研究擬通過建立能有效地針對動物產(chǎn)品中的含有這兩種基因型的產(chǎn)ESBLs耐藥大腸埃希菌進行特異性檢測的方法并開展相關(guān)監(jiān)測工作，以將耐藥大腸埃希菌食品抵御至國門之外，從而增強政府對產(chǎn)ESBLs耐藥性大腸埃希菌的有效預(yù)警和防控能力，以及應(yīng)對突發(fā)公共衛(wèi)生事件的能力。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細菌 不產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌（ATCC25922）標準陰性菌株，購自國家微生物菌種保存中心；產(chǎn)CTX－M基因型ESBLs菌株和TEM基因型ESBLs菌株、產(chǎn)SHV基因型ESBLs菌株和產(chǎn)OXA基因型ESBLs菌株，由深圳出入境檢驗檢疫局動檢實驗室分離并經(jīng)中國動物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心鑒定；O157∶H7大腸埃希菌、沙門菌、單增李斯特菌，均由深圳檢驗檢疫局實驗室保存。

1.1.2 試劑 PCR試劑盒（QIAGEN Multiplex PCR Kit）為Qiagen公司產(chǎn)品；細菌DNA抽提試劑盒（EZ1DNA Tissue Kit）為 Qiagen公司產(chǎn)品；AST－GN13藥敏卡為生物梅里埃公司產(chǎn)品；MH瓊脂藥敏用培養(yǎng)基為北京陸橋公司產(chǎn)品；頭孢他啶（CAZ，30μg／片）、頭孢噻肟（CTX－M，30μg／片）、氨曲南（AZT，30μg／片）、頭孢曲松（CRO）、頭孢他啶／克拉維酸（CAZ／clav，30μg／10μg）、頭孢噻肟／克拉維酸（CTX－M／clav，30μg／10μg）藥敏紙片為北京天壇藥物生物技術(shù)開發(fā)公司產(chǎn)品。

1.1.3 儀 器 PCR 儀 （Veriti，Applied Biosystems），高速冷凍離心機 （3K15，Sigma），VITEK－2細菌鑒定系統(tǒng)（生物梅里埃）。

1.2 方法

1.2.1 引物的設(shè)計與合成 根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫中產(chǎn)CTX－M 型（GenBank：JX129222.1）、TEM 型（GenBank：JX129214.1）、SHV 型 （GenBank：EU376967.1）、OXA 型（GenBank：AY841859.1）ESBLs菌株ESBLs基因的核苷酸序列，利用DNA Star生物軟件進行同源性分析，并參照文獻篩選出耐藥菌株ESBLs基因中相對保守且高度特異的核苷酸片段，設(shè)計出針對CTX－M 型和TEM 型ESBLs的通用引物。引物序列和名稱見表1，引物由寶生物工程（大連）有限公司合成。

表1 CTX－M型和TEM型兩種基因型的引物與預(yù)期擴增片段Table 1 Primers of two gene type of ESBLs and amplification fragment

1.2.2 產(chǎn)ESBLs陽性菌基因組的抽提 將TEM ESBLs基因型菌株、SHV ESBLs基因型菌株、CTX－M ESBLs基因型菌株和OXA ESBLs陽性菌株接種于緩沖蛋白胨水中，混勻。36℃±1℃培養(yǎng)18h～24h，3 000r／min離心10min，參照 Qiagen公司EZ1核酸自動抽提工作站抽提細菌基因組方法，取菌泥抽提細菌核酸。

1.2.3 產(chǎn)CTX－M和TEM 基因型ESBLs大腸埃希菌雙重PCR檢測方法的建立 參照Qiagen公司QIAGEN Multiplex PCR Kit操作說明書配制PCR反應(yīng)液：每個50μL的反應(yīng)體系中包含2×QIA－GEN Multiplex PCR Master Mix 25μL，10μmol／L上游引物1μL，10μmol／L下游引物1μL，無核酸酶的水13μL，模板10μL。于ABI verity PCR儀進行PCR擴增。反應(yīng)程序如下：94℃4min，94℃30s，56℃60s，72℃60s，32個循環(huán)；72℃7min。分別以TEM ESBLs基因型菌株和CTX－M ESBLs基因型菌株核酸為模板進行檢測，同時將TEM ESBLs基因型菌株和CTX－M ESBLs基因型菌株混合后抽提核酸進行雙重PCR檢測，同時設(shè)置陰性對照。

1.2.4 PCR檢測方法靈敏性試驗 將TEM ES－BLs基因型菌株和CTX－M ESBLs基因型菌株進行10倍系列稀釋，同時進行單重PCR檢測和混合后雙重PCR檢測，確定所建PCR檢測方法單重檢測的靈敏度和雙重檢測的靈敏度。

1.2.5 PCR檢測方法特異性試驗 利用建立的檢測方法對TEM ESBLs基因型菌株、SHV ESBLs基因型菌株、CTX－M ESBLs基因型菌株、OXA ESBLs基因型菌株、O157∶H7大腸埃希菌、沙門菌、單增李斯特菌等菌株進行檢測，確定所建立方法的特異性。

1.2.6 冷凍畜禽肉樣品的檢測 為了驗證所建方法的實用性，隨機抽取623份冷凍畜禽肉樣品進行檢測。無菌操作取25g剪碎的樣品（或取血樣）加入到225mL緩沖蛋白胨水中進行預(yù)增菌，將預(yù)增菌液接種ChromIDESBL顯色平板，36℃±1℃培養(yǎng)18h～24h；挑取酒紅色可疑菌落，革蘭染色陰性的桿菌接種血瓊脂平板，36℃±1℃培養(yǎng)18h～24h，保存，用建立的方法進行檢測。同時用VITEK－2細菌鑒定系統(tǒng)和NCCLSM100－S10法對樣品進行檢測，并將檢測結(jié)果進行比較，確定所建立的方法與經(jīng)典檢測方法的符合率，評價其可靠性及臨床實用性。

1.2.6.1 PCR篩選檢測 抽提上述純化的可疑菌株的DNA，利用建立的CTX－M和TEM兩種基因型ESBLs菌株P(guān)CR快速檢測方法進行檢測。

1.2.6.2 VITEK－2細菌鑒定系統(tǒng)檢測 將上述純培養(yǎng)的菌株按實驗要求稀釋后，按照VITEK－2細菌鑒定系統(tǒng)操作說明書，放入VITEK－2細菌鑒定系統(tǒng)中同時進行生化鑒定及藥敏檢測。

1.2.6.3 NCCLSM100－S10分離法鑒定 對所有PCR篩選陽性和VITEK－2細菌鑒定系統(tǒng)鑒定為陽性的可疑菌株按照2000年NCCLSM100－S10推薦的方法進行復(fù)核確證，分離方法為：將純培養(yǎng)的菌株按試驗要求稀釋后涂布于MH平板上，同時采用紙片擴散法初篩和雙紙片試驗確證。

（1）紙片篩選試驗：按標準紙片擴散法的規(guī)定進行，選用 CTX－M、CAZ、ATM、CRO 4種藥敏紙片做篩選試驗，37℃經(jīng)18h觀察結(jié)果。CAZ大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌抑菌環(huán)直徑≤22mm，CRO≤25mm，CTX－M 和 ATM 抑 菌 環(huán) 直 徑≤27mm的細菌懷疑為產(chǎn)ESBLs菌株。

（2）確認試驗：按標準紙片擴散法的規(guī)定進行，用CAZ和 CAZ／clav，CTX－M 和 CTX－M／clav，兩組藥敏紙片分別做確認試驗。

（3）結(jié)果判讀：含克拉維酸的藥敏紙片與其相應(yīng)不含克拉維酸的藥敏紙片抑菌環(huán)直徑的差值≥5mm，確定為產(chǎn)ESBLs菌株［4］。

2 結(jié)果

2.1 產(chǎn)CTX－M和TEM基因型ESBLs菌PCR擴增結(jié)果

在50μL反應(yīng)體系中，以針對CTX－M基因型ESBLs的引物檢測CTX－M基因型ESBLs菌株，可特異性擴增出544bp的目的片段；以針對TEM基因型ESBLs的引物檢測TEM ESBLs基因型菌株，可特異性擴增出717bp的目的片段；將產(chǎn)CTX－M和TEM兩種基因型ESBLs菌株引物混合，同時檢測CTX－M ESBLs基因型菌株和TEM ESBLs基因型菌株混合樣品，可特異性擴增出544bp和717bp的兩條目的片段。對其他菌株進行PCR單重擴增和雙重擴增檢測時，結(jié)果全部為陰性（圖1）。說明所建立的CTX－M和TEM兩種基因型ESBLs菌株P(guān)CR擴增方法特異。

圖1 產(chǎn)CTX－M和TEM兩種基因型ESBLs菌株P(guān)CR檢測電泳圖Fig.1 PCR amplification results of CTX－M ＆ TEM gene type of ESBLs

2.2 PCR方法靈敏度試驗結(jié)果

將TEM ESBLs基因型菌株和CTX－M ESBLs基因型菌株進行10倍系列稀釋，于EZ1儀器上自動抽提核酸。用所建立的PCR方法，同時進行單重PCR檢測和混合后雙重PCR檢測，進行靈敏度檢測。結(jié)果顯示，產(chǎn)CTX－M基因型ESBLs菌株P(guān)CR方法檢測CTX－M ESBLs基因型菌株的靈敏度為10－5，產(chǎn)TEM 基因型ESBLs菌株P(guān)CR方法檢測TEM ESBLs陽性菌株靈敏度為10－4，雙重PCR方法檢測CTX－M基因型耐藥菌株靈敏度為10－4，檢測TEM ESBLs基因型耐藥菌株靈敏度為10－4（圖2）。

圖2 兩種基因型PCR敏感性試驗結(jié)果Fig.2 Sensitivity test results of PCR for two gene types

2.3 PCR方法特異性試驗結(jié)果

用所建立的PCR方法，對TEM ESBLs基因型菌株和SHV ESBLs基因型菌株分別進行單重PCR檢測，對CTX－M ESBLs菌株、OXA ESBLs菌株、O157∶H7大腸埃希菌、沙門菌、單增李斯特菌等進行雙重檢測，結(jié)果相應(yīng)的ESBLs基因型引物只特異性地擴增出相應(yīng)基因型的耐藥菌株（圖3），證明所建立的方法具有特異性。

2.4 冷凍畜禽肉樣品的檢測結(jié)果

采用本研究建立的CTX－M ESBLs和TEM ESBLs兩種基因型菌株P(guān)CR檢測方法，對623份冷凍畜禽肉樣品進行檢測。共檢測出產(chǎn)CTX－M ESBLs基因型菌株13株，產(chǎn)TEM ESBLs基因型菌株1株，產(chǎn)CTX－M和TEM兩種基因ESBLs菌株9株。

所有樣品經(jīng)VITEK－2細菌鑒定系統(tǒng)鑒定，確定可疑產(chǎn)ESBLs菌株為10株，經(jīng)VITEK2Compact應(yīng)用軟件分析確定為產(chǎn)CTX－M基因型菌株。檢測結(jié)果見表2。

圖3 CTX－M和TEM兩種基因型雙重PCR特異性試驗結(jié)果Fig.3 Specificity test results of the duplex PCR for two gene types

表2 VITEK－2細菌鑒定系統(tǒng)鑒定的陽性輸出結(jié)果Table 2 Identification of ten E.coli from VITEK－2

采用NCCLSM100－S10推薦的紙片擴散法初篩試驗和雙紙片確證試驗。對照菌大腸埃希菌ATCC25922和肺炎克雷伯菌ATCC700603的質(zhì)控結(jié)果均在規(guī)定的質(zhì)控允許范圍內(nèi)，用CTX－M、CAZ、ATM、CRO 4種藥敏紙片篩選產(chǎn)ESBLs菌株時，若抑菌環(huán)直徑CAZ≤22mm，CRO≤25mm，CTX－M≤27mm，ATM≤27mm時，為可疑產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌。再用CAZ和CAZ／clav，CTX－M和CTX－M／clav組藥敏紙片分別做確認試驗。結(jié)果13株細菌在含克拉維酸的藥敏紙片與其相應(yīng)不含克拉維酸的藥敏紙片抑菌環(huán)直徑的差值≥5mm。因此，13株可疑陽性菌株全部為產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌菌株。

3 討論

大腸埃希菌中產(chǎn)ESBLs的檢出率較高，其比例有逐年上升趨勢。產(chǎn)ESBLs菌株多數(shù)對青霉素類，第1、2、3代頭孢菌素，喹諾酮類，磺胺類及氨基糖苷類等抗菌藥物呈多重耐藥［5］。ESBLs由普通β－內(nèi)酰胺酶TEM－1、TEM－2和SHV－1經(jīng)個別氨基酸突變形成，由質(zhì)粒介導(dǎo)，易在同種屬甚至不同種屬細菌間傳遞造成暴發(fā)流行。目前已發(fā)現(xiàn)有300多種，根據(jù)其質(zhì)粒編碼的基因和酶底物的不同，ESBLs基因型有TEM型、SHV型、CTX－M型、OXA型及其他型共5種，每個基因型又有很多亞型。細菌及其所受抗生素選擇壓力不同，其產(chǎn)生的ESBLs基因型、基因亞型亦不同［6］。大腸埃希菌中ESBLs以TEM基因型和CTX－M基因型為主，產(chǎn)PER型（PERβlactamases）、VEB 型（VEBβ－lactamases）、GES 型（GESβ－lactamases）和 BES型（BESβ－lactamases）等少見類型ESBLs菌株也在不斷增加。苑麗等［1］對河南省耐藥菌株普查監(jiān)測表明，產(chǎn)ESBLs耐藥大腸埃希菌占54.7%（35／64），其中38株攜帶 TEM基因ESBLs，19株攜帶CTX－M基因ESBLs，說明產(chǎn)TEM和CTX－M型ESBLs耐藥菌株仍然是目前流行的主要耐藥菌株。各個國家和地區(qū)使用的抗菌藥物不同，流行的ESBLs基因型各不相同。ESBLs的傳播及它們造成的多重耐藥性給臨床抗生素治療造成了極大困難，及時準確檢出ESBLs基因型對防止產(chǎn)ESBLs菌株流行、控制醫(yī)院內(nèi)感染和指導(dǎo)臨床治療有著非常重要的意義［7－8］。

鑒于TEM和CTX－M基因型耐藥菌株仍然是目前耐藥菌株的主要亞型，在進出口檢疫中，對進口畜禽凍肉產(chǎn)品中耐藥菌株的檢測和監(jiān)測就顯得尤為重要和迫切。由于人為因素等原因，采用國際上通用的NCCLSM100－S10推薦方法——雙紙片法進行鑒定時耗時耗力，有時會產(chǎn)生人為誤差，易導(dǎo)致細菌漏檢。我國盡管已經(jīng)高度關(guān)注耐藥菌株造成的公共衛(wèi)生問題和食品安全問題，但目前尚無一種快速方便的檢測方法。本研究建立的產(chǎn)ESBLs菌株快速檢測方法為實際檢測提供有效的工具。而對耐藥菌株不斷增加的嚴峻形勢，有必要盡快開展相關(guān)監(jiān)測工作和技術(shù)儲備，以便應(yīng)對國際貿(mào)易中耐藥性細菌對我國食品安全的沖擊。

綜上所述，本研究建立了兩種常見的產(chǎn)TEM和CTX－M基因型ESBLs大腸埃希菌的分子生物學(xué)快速檢測方法，其突出的優(yōu)點，一是針對性強，能有效地對產(chǎn)TEM和CTX－M基因型ESBLs大腸埃希菌進行特異性檢測和監(jiān)測；二是檢測效率高，可大大縮短檢測周期，提高通關(guān)速度。

［1］ 苑 麗，劉建華，胡功政，等.30株雞大腸桿菌ESBLs基因型檢測及耐藥性分析［J］.中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報，2009，31（6）：438－442.

［2］ Yuan L，Liu J H，Hu G Z，et al.Molecular characterization of extended－spectrum－beta－lactamase－producing E. coliisolates from chickens in Henan Province，China［J］.J Med Microbiol，2009，58：1449－1453.

［3］ Johnson J R，Urban C，Weissman S J，et al.Molecular epidemi－ological analysis of Escherichia coli sequence type ST131（O25∶H4）and blaCTX－M－15among［J］.Antimicrob Agents Chemother，2012，56（5）：2364－2370.

［4］ Centers for disease control and prevention.Laboratory Detection of Extended－Spectrumβ－Lactamases（ESBLs）［EB／OL］.［2013－03－01］.http：／／www.cdc.gov／hai／settings／lab／lab＿esbl.html.

［5］ 裴亞玲.雞源大腸桿菌ESBLs基因型檢測［D］.河南鄭州：河南農(nóng)業(yè)大學(xué)，2009.

［6］ 胡功政，孫亞偉，陳紅英，等.雞志賀氏菌產(chǎn)超廣譜β內(nèi)酰胺酶（ESBLs）的基因分型［C］／／河南省畜牧獸醫(yī)學(xué)會第七屆理事會第二次會議暨2008年學(xué)術(shù)研討會論文集.2008.

［7］ Hansen K H，Damborg P，Andreasen M，et al.A carriage and fecal counts of cefotaxime M－producing Escherichia coli in pigs：a longitudinal study［J］.Appl Environ Microbiol，2011，79（3）：794－798.

［8］ Chemother J A.CTX－M：changing the face of ESBLs in Europe［J］.J Antimicrob Chemother，2007，59（2）：165－174.