高繼國(guó)，惠識(shí)瑤,，耿麗麗，張 蕊，孫長(zhǎng)坡，張 杰

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，哈爾濱 150030；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所植物病蟲(chóng)害生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193；3.國(guó)家糧食局科學(xué)研究院，北京 100037）

多不飽和脂肪酸（Polyunsaturated fatty acids,PUFAs）指含有兩個(gè)或兩個(gè)以上雙鍵且碳鏈長(zhǎng)為16～22個(gè)碳原子的直鏈脂肪酸[1-2]。根據(jù)多不飽和脂肪酸分子甲基端起第一個(gè)不飽和雙鍵所連結(jié)的碳原子在碳鏈中的位置不同，將PUFAs分為ω-3和ω-6兩類(lèi)[3-4]。α-亞麻酸（Alpha-linolenic acid，ALA）是ω-3多不飽和脂肪酸中的一種，對(duì)促進(jìn)人體健康具有重要作用，尤其可以促進(jìn)大腦發(fā)育[5-6]。ALA是對(duì)人體有益的長(zhǎng)鏈不飽和脂肪酸二十碳五烯酸（Eicosapentaenoic acid，EPA）和二十二碳六烯酸（Docosahexenoic acid，DHA）的合成前體物質(zhì)，ALA通過(guò)對(duì)同一種必需酶的競(jìng)爭(zhēng)消耗，抑制ω-6脂肪酸的延伸從而達(dá)到平衡人體內(nèi)ω-3與ω-6脂肪酸水平的功效[7-9]。但是，由于人體內(nèi)缺乏必要的脫氫酶，不能合成ALA和亞油酸（Linoleic acid，LA）此類(lèi)基本的脂肪酸，所以只能從飲食中攝取相應(yīng)的不飽和脂肪酸[10]。

脂肪酸脫氫酶（Fatty acid desaturase，F(xiàn)AD）是催化脂肪酸鏈特定位置形成雙鍵和產(chǎn)生不飽和脂肪酸的酶類(lèi)。植物脂肪酸脫氫酶主要有ω-3（FAD3、FAD7、FAD8）和ω-6（FAD2、FAD6）兩大類(lèi)[11-12]，其中FAD2和FAD 3在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，F(xiàn)AD6、FAD 7和FAD 8在脂質(zhì)中[13-14]。FAD8屬于ω-3脂肪酸脫氫酶，是ALA合成的關(guān)鍵酶[15-17]，此酶在LA（18∶2）脂肪酸鏈的距甲基端的第三個(gè)碳原子處引入雙鍵生成ALA（18∶3）[18]。

花生（Arachis hypogaea L.）是世界第四大油料作物，花生籽粒含油量約占種子干重的44.27%～53.86%；而其儲(chǔ)藏油脂中80%左右為不飽和脂肪酸（其中油酸36%～67%，亞油酸15%～43%）[19]。目前，花生ω-6脂肪酸脫氫酶基因已被克隆，且已成功將AhFAD2A和AhFAD2B轉(zhuǎn)入大腸桿菌和釀酒酵母中，誘導(dǎo)表達(dá)并分析其脫氫酶活性。但是，對(duì)于花生ω-3多不飽和脂肪酸代謝合成以及相關(guān)酶的研究還未見(jiàn)報(bào)道。牛麗紅等成功克隆擬南芥和萊茵衣藻中的ω-3脂肪酸脫氫酶基因，在畢赤酵母中誘導(dǎo)表達(dá)，并且分析其生物活性[20-21]。

本研究生在物信息學(xué)分析基礎(chǔ)上，利用電子克隆結(jié)合RT-PCR方法克隆花生ω-3脂肪酸脫氫酶基因（FAD8），構(gòu)建ω-3脂肪酸脫氫酶的真核表達(dá)載體，在畢赤酵母中表達(dá)，分析其生物學(xué)功能，為花生不飽和脂肪酸代謝的研究奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料

花生（Arachis hypogaea L.）品種為白沙 1016，由山東省花生研究所提供。

1.1.2 菌株與質(zhì)粒

大腸桿菌（Escherichia coil）DH5α、畢赤酵母（Pichia pastoris）GS115、pPIC3.5K酵母游離型穿梭表達(dá)載體由本實(shí)驗(yàn)室保存，T載體pMD19-T購(gòu)自TaKaRa公司，RNAsimple Total RNA試劑盒購(gòu)自Tiangen公司。

1.1.3 試劑和培養(yǎng)基

LB液體培養(yǎng)基：NaCl 1%，Tryptone 1%，Yeast extract 0.5%，pH 7.0，0.1 MPa滅菌20 min。固體LB培養(yǎng)基：在液體LB培養(yǎng)基中加入瓊脂，濃度為1.3%。畢赤酵母YDB基礎(chǔ)培養(yǎng)基、RDB篩選培養(yǎng)基及BMGY和BMMY誘導(dǎo)表達(dá)培養(yǎng)基等配置方法參照Invitrogen公司畢赤酵母操作說(shuō)明進(jìn)行。

抗生素：氨芐青霉素100 mg·mL-1，卡那霉素100 mg·mL-1，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

Taq DNA聚合酶、Ex Taq DNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶及T4DNA連接酶等購(gòu)自TaKaRa公司；引物由上海生工生物工程公司合成；2×Taq Mix PCR擴(kuò)增試劑購(gòu)自北京博邁得生物技術(shù)有限公司；DNA回收試劑盒、質(zhì)粒小量提取試劑盒等購(gòu)自Axygen公司；Trizol試劑購(gòu)自Invitrogen公司；其他均為市售國(guó)產(chǎn)、進(jìn)口分析純?cè)噭?/p>

1.2 方法

1.2.1 ω-3脂肪酸脫氫酶基因的電子克隆

采用DNAMAN軟件比對(duì)GenBank中下載的9種植物ω-3脂肪酸脫氫酶基因序列，選取保守片段作為種子序列，利用BioEdit軟件在本實(shí)驗(yàn)室花生不同時(shí)期的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)庫(kù)中調(diào)取同源性較高的序列片段，結(jié)合Peanut DB花生數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.bioinfolab.org/txid3818v1）（世界上第一個(gè)花生數(shù)據(jù)庫(kù)網(wǎng)站，由本實(shí)驗(yàn)室完成花生轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，與美國(guó)Miami University Dr Liang Chun實(shí)驗(yàn)室合作建立）中對(duì)于花生ω-3脂肪酸代謝途徑中相關(guān)酶的序列信息，得到候選序列。根據(jù)NCBI、EBI、GenBank、EXPACY和Soflberry等網(wǎng)站提供的各種在線生物信息學(xué)軟件進(jìn)行綜合分析預(yù)測(cè)，并與同類(lèi)植物已克隆的ω-3脫氫酶進(jìn)行比較分析，克隆出花生ω-3脂肪酸脫氫酶基因全長(zhǎng)序列。引物由上海Sangon合成：

AhFAD85f：5'TACGTAACCATGGCAACATGG GTCTTATC 3'

AhFAD83r：5'GCGGCCGCTTAAATTGATGTA GAAGAGCC 3'

1.2.2 AhFAD8基因全長(zhǎng)cDNA序列的獲得

花生未成熟種子總RNA的提取參照Trizol說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，使用RNAsimple Total RNA Kit純化分離mRNA。取1 μg所提總RNA為模板，Oligo（dT）為反轉(zhuǎn)錄引物，70℃保溫4 min后立即冰浴，然后分別加入 5×primescript buffer 4 μL，dNTP，RNase inhibitor，M-MLV各0.5 μL，加DEPC處理水至20 μL，42℃反應(yīng)90 min，合成第一鏈cDNA。以AhFAD85f、AhFAD83r為引物，以反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增條件：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性1 min，58℃ 30 s，72℃延伸30 s，35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10 min。

1.2.3 AhFAD8基因克隆、測(cè)序

將PCR產(chǎn)物回收并克隆到pMD19-T載體中，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，藍(lán)白斑篩選和酶切鑒定陽(yáng)性克隆，挑取正確的陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序。序列測(cè)定由北京天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司完成。

1.2.4 AhFAD8基因表達(dá)載體的構(gòu)建

利用酶Sna B I和NotⅠ將目的基因片段從pMDFAD8上切下插入pPIC3.5K，得到重組表達(dá)載體。大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備、載體構(gòu)建、轉(zhuǎn)化和重組質(zhì)粒的篩選和鑒定均參見(jiàn)文獻(xiàn)[19]。

1.2.5 畢赤酵母細(xì)胞的轉(zhuǎn)化及陽(yáng)性克隆的鑒定

用限制性內(nèi)切酶Sna B I分別對(duì)pPIC3.5K及重組載體進(jìn)行線性化處理，然后采用電穿孔法轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115感受態(tài)細(xì)胞。電轉(zhuǎn)化條件參見(jiàn)文獻(xiàn)[20]，取上清液為模板，以AhFAD85f和AhFAD83r為引物進(jìn)行PCR鑒定，檢驗(yàn)?zāi)康幕蚴欠褚颜系疆叧嘟湍富蚪MDNA中。從RDB培養(yǎng)基上挑取生長(zhǎng)較好的轉(zhuǎn)化子，進(jìn)一步轉(zhuǎn)接到G418濃度分別為1.0、2.0、4.0 mg·mL-1的平板上進(jìn)行篩選，得到高拷貝轉(zhuǎn)化子。

1.2.6 酵母工程菌的表達(dá)

分別挑取單陽(yáng)性克隆，接種于裝有BMGY培養(yǎng)基中，28℃，220 r·min-1培養(yǎng)至OD600=3.0；收集菌體，菌體重懸于BMMY培養(yǎng)基中，甲醇終濃度為0.5%，28℃，220 r·min-1誘導(dǎo)表達(dá)；每24 h向培養(yǎng)基中添加100%甲醇至其終濃度為0.5%；誘導(dǎo)72 h后，離心收集菌體，菌體用無(wú)菌水洗滌3次。

1.2.7 重組基因表達(dá)產(chǎn)物樣品的制備

重組表達(dá)產(chǎn)物樣品的制備方法詳見(jiàn)文獻(xiàn)[20]。

1.2.8 重組基因表達(dá)產(chǎn)物樣品氣相色譜（GC）分析

采用Agilent 6890N氣相色譜儀，色譜柱為VF-23MS，規(guī)格為30 m×0.25 mm×0.25 μm，分流比100∶1，進(jìn)樣口溫度260℃，檢測(cè)器溫度260℃，程序升溫：110℃3 min，以4℃·min-1的速度上升至220℃保溫15 min。

2 結(jié)果與分析

2.1 花生FAD8基因的cDNA克隆與序列分析

擴(kuò)增得到花生FAD8基因的cDNA，電泳檢測(cè)到一條約1.4 kp的條帶（圖略），測(cè)序結(jié)果表明該cDNA片段含有1 368 bp，由此推測(cè)該基因編碼456個(gè)氨基酸，與大豆（Glycine max）FAD8（NM0012516 80.1）序列相似性最高，為88%；與大豆等10個(gè)物種的FAD8氨基酸序列作多重比對(duì)，建立11個(gè)物種的FAD8脫氫酶的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)如圖1所示，結(jié)果表明花生FAD8與（Glycine max）和豇豆（Vigna uiculata chloroplast）進(jìn)化關(guān)系最近，而與畢赤酵母（Pichia pastoris）進(jìn)化關(guān)系最遠(yuǎn)。

圖1 11種ω-3脫氫酶的分子系統(tǒng)發(fā)育Fig.1 Molecular phylogenetic tree of 11 kinds of ω-3 FADs

2.2 表達(dá)載體的構(gòu)建及陽(yáng)性克隆的鑒定

構(gòu)建表達(dá)載體獲得重組質(zhì)粒p3.5K8（見(jiàn)圖2），挑取陽(yáng)性克隆，酶切鑒定顯示，p3.5K8經(jīng)Sna BⅠ和NotⅠ雙酶切分別產(chǎn)生9.3 kb及1.4 kb兩條帶，經(jīng)Sna BⅠ單酶切僅有10.7 kb一條帶；空載體pPIC3.5K經(jīng)同樣酶切僅有9.3 kb一條帶（見(jiàn)圖3），說(shuō)明AhFAD8基因已成功克隆到pPIC3.5K中。

2.3 AhFAD8基因在畢赤酵母中的表達(dá)

以引物AhFAD85f與AhFAD83r對(duì)轉(zhuǎn)化子進(jìn)行鑒定，結(jié)果表明目的基因已整合入畢赤酵母基因組中。RT-PCR檢測(cè)結(jié)果說(shuō)明AhFAD8基因在畢赤酵母中能夠正常轉(zhuǎn)錄（見(jiàn)圖4）。

圖2 p3.5K8質(zhì)粒的構(gòu)建Fig.2 Construction of p3.5K8 plasmid

圖3 重組質(zhì)粒p3.5K8的酶切及PCR分析Fig.3 Restrictive digestion and PCR analysis of recombinant plasmid p3.5K8

2.4 花生FAD8脫氫酶的活性分析

圖4 轉(zhuǎn)脫氫酶基因畢赤酵母RT-PCR檢測(cè)結(jié)果Fig.4 RT-PCR Result of Pichia pastoris transformants with desaturase genes

畢赤酵母工程菌經(jīng)細(xì)胞破碎、提取、對(duì)總脂肪酸進(jìn)行甲酯化后，經(jīng)GC檢測(cè)，對(duì)圖譜進(jìn)行分析，得到畢赤酵母每種具體的脂肪酸的物質(zhì)的量含量，并依照去飽和率計(jì)算4個(gè)轉(zhuǎn)化子亞油酸的去飽和率及平均去飽和率，飽和率（%）=產(chǎn)物含量/（產(chǎn)物含量+底物含量）×100%，結(jié)果見(jiàn)表1，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)AhFAD8的畢赤酵母比轉(zhuǎn)空載體pPIC3.5K的畢赤酵母亞油酸的平均去飽和率高。如圖5所示，圖5A為轉(zhuǎn)空載體對(duì)照，圖5B為轉(zhuǎn)化含AhFAD8基因的畢赤酵母中亞油酸的平均去飽和率，可見(jiàn)轉(zhuǎn)入AhFAD8基因后亞油酸的平均去飽和率升高25.5%，證明在畢赤酵母中表達(dá)的花生FAD8脫氫酶基因具有脫氫活性。

表1 畢赤酵母中亞油酸的去飽和率Table1 Desaturation rate of LA in Pichia pastoris

3 討論與結(jié)論

本研究通過(guò)多種植物以及畢赤酵母的ω-3脫氫酶基因序列比對(duì)分析得到FAD8脫氫酶基因的保守區(qū)，利用本實(shí)驗(yàn)室花生不同時(shí)期的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)以及Peanut BD數(shù)據(jù)庫(kù)的信息，結(jié)合RT-PCR方法，首次克隆花生AhFAD8脫氫酶全長(zhǎng)cDNA，并在畢赤酵母中成功表達(dá)該基因，通過(guò)不飽和脂肪酸分析證實(shí)該基因表達(dá)產(chǎn)物具有一定的ω-3脫氫酶活性，為花生以及其他油料作物脂肪酸代謝合成的相關(guān)基因研究創(chuàng)造條件。

本研究采用外源蛋白表達(dá)系統(tǒng)為巴斯德畢赤酵母（Pichia pastoris），克服釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）分泌效率低、表達(dá)菌株不夠穩(wěn)定、表達(dá)質(zhì)粒易丟失等缺陷[22-24]。其本身含有豐富的油酸和亞油酸，可在不加其他底物的情況下，直接用于脫氫酶基因的生物學(xué)功能的驗(yàn)證[25-27]。通過(guò)對(duì)脂肪酸脫氫酶的真核表達(dá)，摸索出利用畢赤酵母的真核表達(dá)的技術(shù)路線，為其他脫氫酶基因的真核異源表達(dá)提供技術(shù)支持。

本研究中AhFAD8基因在畢赤酵母中表達(dá)，亞油酸去飽和率由25.9%上升到32.5%，上升25.5%，證實(shí)此酶能異源表達(dá)，而且具有一定脫氫酶活性。但是，畢赤酵母中ω-3不飽和脂肪酸合成代謝途徑與植物有一定區(qū)別，缺少植物中特有的調(diào)控機(jī)制，從而影響脂肪酸脫氫酶的表達(dá)及活性，后續(xù)研究擬將該脫氫酶基因轉(zhuǎn)入模式植物擬南芥，并研究其生物活性。

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