胡寶忠，黃莎莎，李鳳蘭，王多佳

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，哈爾濱 150030）

McQueen-Mason等首次在黃瓜下胚軸細(xì)胞壁中鑒定出相對(duì)分子質(zhì)量為29和30 ku的兩種蛋白質(zhì)，其為在植物細(xì)胞生長(zhǎng)期間釋放且能使細(xì)胞壁軟化、伸展的蛋白[1]。此后在許多植物中都發(fā)現(xiàn)了膨脹素。植物生長(zhǎng)會(huì)受到細(xì)胞壁限制，因此膨脹素對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)具有重要作用。通過(guò)近年對(duì)膨脹素的研究發(fā)現(xiàn)，膨脹素并不能直接水解纖維素分子的糖苷鍵，而是把細(xì)胞壁中的纖維素鏈間的氫鍵打斷，有效破壞纖維素結(jié)構(gòu)，使其從結(jié)晶狀態(tài)轉(zhuǎn)化為非結(jié)晶狀態(tài)，有效降低纖維素強(qiáng)度[2-3]，從而有效提高纖維素酶對(duì)纖維素的水解程度。

纖維素是由D-葡萄糖以β-1，4-糖苷鍵相聯(lián)結(jié)而成，直鏈狀大分子纖維素折疊起來(lái)，形成具有高結(jié)晶的基本構(gòu)成單位，由這種基本構(gòu)成單位集中起來(lái)構(gòu)成微小的結(jié)構(gòu)單位，再由很多微小單位構(gòu)成千差萬(wàn)別、不同長(zhǎng)度的纖維素[4]。它不但是地球表面天然起源的重要有機(jī)物質(zhì)之一，而其降解還是自然界碳素循環(huán)的中心環(huán)節(jié)。利用植物類纖維這一可再生資源生產(chǎn)燃料酒精的研究已在世界各地逐步展開(kāi)[5]。纖維素也是自然界中分布最廣、含量最多的一種多糖，但由于纖維素的高結(jié)晶度導(dǎo)致將其水解成可利用的葡萄糖難度很大。大大浪費(fèi)纖維素中儲(chǔ)存的能量，甚至還有可能造成環(huán)境污染。因此，膨脹素的發(fā)現(xiàn)對(duì)于提高纖維素的水解效率具有重要意義。

膨脹因子在細(xì)胞分泌物中含量很少，僅靠分離純化以滿足工業(yè)應(yīng)用的需要[6]。目前通過(guò)真核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)膨脹素蛋白已有大量研究，因此本文利用巴氏德畢赤酵母表達(dá)矮化黃瓜突變體Cs-EXPA1基因，并研究重組蛋白與纖維素酶協(xié)同降解纖維素的最適反應(yīng)條件。為提高纖維素的水解效率提供理論依據(jù)，對(duì)有效利用纖維素資源解決食品、能源等缺乏問(wèn)題具有重要的理論和現(xiàn)實(shí)意義。

1 材料與方法

1.1 材料

黃瓜矮化突變體“D0462”，由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院黃瓜課題組提供；大腸桿菌感受態(tài)DH5α購(gòu)自哈爾濱海基生物公司；。巴氏德畢赤酵母菌株（P.pastorisGS115）和表達(dá)載體pGAPHαM由黑龍江省酶制劑工程研究中心提供；pMD18-T載體購(gòu)自大連寶生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 膨脹素基因的分離

在花盆中播種矮化突變體黃瓜種子，待其長(zhǎng)到4～6 cm高時(shí)，取100 mg材料用Trizol法（Invitrigen公司）提取RNA，采用TaKaRa公司PrimeScriptTMRT-PCR Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書合成cDNA第一鏈，根據(jù)GenBank中Cs-EXPA1登錄號(hào)U30382.1設(shè)計(jì)合成一對(duì)引物，上游C1：5'GAATT CGACTACGGTGGCTGGCAGAG 3'，下游C2：5'GC GGCCGCTTAGAATTGAGGGCCTTCATAGG 3'。下劃線為EcoRⅠ和NotⅠ酶切位點(diǎn)。

以第1鏈cDNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)條件為94℃ 5 min一個(gè)循環(huán)；94℃ 10 s；55℃ 10 s；72℃30 s；共30個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸5 min。反應(yīng)產(chǎn)物從1%瓊脂糖凝膠上回收后，克隆入pMD-18T載體（TaKaRa），轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，提取質(zhì)粒鑒定后由南京博仕公司測(cè)序。

1.2.2 表達(dá)載體的構(gòu)建及重組畢赤酵母的篩選

RT-PCR特異性擴(kuò)增產(chǎn)物與表達(dá)質(zhì)粒pGAPHαM連接，得到重組質(zhì)粒。采用電擊法進(jìn)行重組質(zhì)粒在畢赤酵母中的轉(zhuǎn)化，在MD平板上進(jìn)行篩選。采用CTAB法提取重組菌株總DNA[7]，并通過(guò)PCR擴(kuò)增以及擴(kuò)增產(chǎn)物的測(cè)序來(lái)鑒定重組子。

1.2.3 Cs-EXPA1基因在畢赤酵母中的表達(dá)

挑取GS115/pGAPHαM-EXPA1單菌落接種至25 mL YPD培養(yǎng)基，30℃，220 r·min-1震蕩培養(yǎng)。收集上清。SDS-PAGE分析重組畢赤酵母培養(yǎng)液。所使用凝膠濃度為12%，上樣量為80 μL。檢測(cè)是否有目的蛋白的表達(dá)。

1.2.4 膨脹素蛋白協(xié)同活性的測(cè)定

取3個(gè)1 cm×6 cm的新華定量濾紙分別浸入盛有1.5 mL 0.05 mol·L-1的檸檬酸緩沖液（pH 4.5）試管中，再分別將無(wú)菌水、GS115發(fā)酵上清液、GS115-EXPA1發(fā)酵上清液各1.5 mL與0.5 mL纖維素酶液分別混合加入各試管中，25℃水浴反應(yīng)4 h后各加入0.5 mL按一定比例配置商品化纖維素酶液，50℃水浴中反應(yīng)30 min，加入1.5 mL DNS溶液終止反應(yīng)，在沸水浴煮沸5 min。流水冷卻后，加入蒸餾水至25 mL，混勻[8]。540 nm下測(cè)定吸光值，根據(jù)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算酶反應(yīng)過(guò)程所釋放的還原糖量。

2 結(jié)果與分析

2.1 Cs-EXPA1基因的分離

Trizol法提取苗期黃瓜D0462總RNA（見(jiàn)圖1）。取1 μL總RNA作為反轉(zhuǎn)錄的模板，合成cDNA第一鏈。再取其2 μL作模板，以C1、C2為引物擴(kuò)增得到約680 bp的Cs-EXPA1基因，1%瓊脂糖凝膠電泳（見(jiàn)圖2）。經(jīng)測(cè)序結(jié)果圖3表明，分離的Cs-EXPA1基因與GenBank上發(fā)布的該序列的mat_peptide區(qū)相似性達(dá)到99%。

圖1 D0462矮化黃瓜總RNA的電泳檢測(cè)Fig.1 Electrophoresis analysis of total RNA of D0462 dwarf cucumber

圖2 Cs-EXPA1基因PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.2 PCR amplification results of of Cs-EXPA1 gene

圖3 Cs-EXPA1基因測(cè)序結(jié)果Fig.3 Sequence result of Cs-EXPA1

2.2 表達(dá)載體的構(gòu)建

將含有pMD18T-EXPA1的正確的轉(zhuǎn)化子于含有氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基37℃，200 r·min-1，振蕩培養(yǎng)過(guò)夜，提取質(zhì)粒DNA，EcoRⅠ和NotⅠ雙酶切，回收約680 bp的目的片段，與相同酶消化的pGAPHαM載體，構(gòu)建組成型表達(dá)載體pGAPHαMEXPA1。轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，得到的轉(zhuǎn)化子經(jīng)EcoRⅠ和NotⅠ雙酶切（見(jiàn)圖4），得到大約7.0 kb和680 bp兩條帶。

2.3 表達(dá)載體pGAPHαM-EXPA1的轉(zhuǎn)化與鑒定

將鑒定正確的pGAPHαM-EXPA1質(zhì)粒以BglⅡ線性化，得到7.0和2.4 kb兩條帶（見(jiàn)圖5），回收較大條帶，制備畢赤酵母GS115菌株的感受態(tài)，通過(guò)電擊將回收的線性化片段轉(zhuǎn)入畢赤酵母中，在MD固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)（見(jiàn)圖6）。用牙簽蘸取少量菌體作為模板，進(jìn)行菌落PCR檢測(cè)（見(jiàn)圖7）。再用CTAB法提取基因組DNA進(jìn)行PCR鑒定（見(jiàn)圖8），得到與目的基因680 bp大小相符的片段，經(jīng)測(cè)序結(jié)果圖9表明Cs-EXPA1基因已通過(guò)同源重組整合進(jìn)入畢赤酵母基因組，保存菌株，以備后續(xù)試驗(yàn)。

2.4 Cs-EXPA1基因在畢赤酵母中的表達(dá)

離心收集發(fā)酵液上清液進(jìn)行SDS-PAGE分析，目標(biāo)蛋白在29 ku處有表達(dá)，但略微偏大（見(jiàn)圖10）?？赡苡捎谠摰鞍字写嬖谄咸烟腔⒘姿峄投喾N修飾位點(diǎn)，糖基化和其他修飾等因素共同作用可改變?cè)摰鞍椎谋碛^分子質(zhì)量[4]。

圖4 pGAPHαM-EXPA1載體的酶切鑒定Fig.4 Enzymes digestion of vector pGAPHα-EXPA1

圖5 pGAPHαM-EXPA1載體BglII線性化Fig.5 Linearization of vector pGAPHαM-EXPA1 by BglII

圖6 pGAPHαM-EXPA1載體電擊轉(zhuǎn)化畢赤酵母Fig.6 Vector pGAPHαM-EXPA1I transformation into Pichia pastoris by electrotransformation

2.5 發(fā)酵液中膨脹素蛋白的生物活性

試驗(yàn)測(cè)定了膨脹素蛋白與纖維素酶協(xié)同水解濾紙的活性。比較纖維素酶、GS115上清和纖維素酶混合物、GS115-EXPA1上清和纖維素酶混合物對(duì)濾紙的作用。結(jié)果如圖11所示，在顯微鏡下（10×）觀察經(jīng)處理的濾紙的崩解情況?？煽闯鼋?jīng)有膨脹素蛋白上清處理后的濾紙邊緣崩解明顯，纖維更加稀松，崩解效果明顯高于纖維素酶單獨(dú)作用的濾紙。

2.6 重組蛋白與纖維素酶協(xié)同作用條件的研究

2.6.1 反應(yīng)時(shí)間對(duì)重組蛋白與纖維素酶協(xié)同作用的影響

如圖12所示，各重組蛋白與纖維素酶協(xié)同作用所產(chǎn)生的還原糖量隨時(shí)間的延長(zhǎng)整體呈上升趨勢(shì)，反應(yīng)1 h時(shí)，便有還原糖產(chǎn)生，隨反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，產(chǎn)生的還原糖量增多。

2.6.2 重組蛋白與纖維素酶協(xié)同作用的pH優(yōu)化

不同pH反應(yīng)環(huán)境對(duì)協(xié)同作用的影響較大見(jiàn)圖13。

圖7 GS115/pGAPHαM-EXPA1轉(zhuǎn)化子PCR鑒定Fig.7 Identification of GS115/pGAPHαM-EXPA1 transformants by PCR

圖8 GS115/pGAPHαM-EXPA1轉(zhuǎn)化子基因組DNA PCR鑒定Fig.8 Identification of GS115/pGAPHαM-EXPA1 transformants genomic DNA by PCR

如圖13所示，pH 4和pH 5時(shí)，產(chǎn)生還原糖量較高，說(shuō)明在該pH范圍內(nèi)，比較適合重組蛋白與纖維素酶的協(xié)同反應(yīng)。在該范圍外的pH不利于協(xié)同反應(yīng)的進(jìn)行，尤其是在pH 3和pH 7時(shí)，協(xié)同作用產(chǎn)生的還原糖量較少，說(shuō)明過(guò)酸不利于協(xié)同反應(yīng)的進(jìn)行。

2.6.3 重組蛋白與纖維素酶協(xié)同作用的溫度優(yōu)化

溫度對(duì)酶的反應(yīng)有較大影響。結(jié)果如圖14所示，30～50℃時(shí)，產(chǎn)生還原糖量呈上升趨勢(shì)，50℃還原糖含量最高；隨著溫度升高，水解活性有所下降，當(dāng)反應(yīng)溫度為70℃時(shí)，分解濾紙產(chǎn)生的還原糖量顯著下降。這可能由于溫度過(guò)高使纖維素酶熱變性所致。

圖10 重組酵母表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE檢測(cè)Fig.10 SDS-PAGE analysis of Pichia pastoris express product

圖11 濾紙的崩解情況Fig.11 Filter paper disintegrated

圖12 反應(yīng)時(shí)間對(duì)協(xié)同作用的影響Fig.12 Effect of reaction time on synergism

圖13 反應(yīng)pH對(duì)協(xié)同作用的影響Fig.13 Effect of reaction pH on synergism

圖14 反應(yīng)溫度對(duì)協(xié)同作用的影響Fig.14 Effect of reaction tempreture on synergism

3 討論

如何將自然界中豐富的纖維素材料以較高效率轉(zhuǎn)化成可直接利用的酒精燃料等能源物質(zhì)，是當(dāng)前國(guó)內(nèi)外開(kāi)發(fā)生物能源的焦點(diǎn)之一[6]。在發(fā)現(xiàn)膨脹素蛋白之后，對(duì)其蛋白功能、作用機(jī)理、理化性質(zhì)、抑制及促進(jìn)因素等方面進(jìn)行大量研究工作。近年大量試驗(yàn)證明，膨脹素蛋白單獨(dú)使用并不能水解纖維素，但在纖維素酶水解纖維素的過(guò)程中表現(xiàn)出明顯的協(xié)同作用[9]，這對(duì)高效分解纖維素具有重大意義。有關(guān)膨脹素蛋白能夠破壞細(xì)胞壁木質(zhì)纖維素微纖維間和細(xì)胞壁多糖單鏈間的氫鍵，從而促進(jìn)纖維素酶水解效率的文章已有報(bào)道。黃萍等通過(guò)用含有膨脹素的重組菌株培養(yǎng)上清液與里氏木霉纖維素酶的混合溶液一起降解纖維素，結(jié)果證實(shí)膨脹素能夠協(xié)助纖維素酶水解纖維素，能使纖維素酶的濾紙酶活力得到有效提高[10]。膨脹素這種性質(zhì)可降低各種纖維素材料轉(zhuǎn)化為可直接利用的能源物質(zhì)，具有良好應(yīng)用前景[11]。本文通過(guò)電擊轉(zhuǎn)化方式將膨脹素蛋白基因成功轉(zhuǎn)入畢赤酵母，并在酵母中成功進(jìn)行Cs-EXPA1蛋白的表達(dá)。通過(guò)濾紙水解試驗(yàn)證明該蛋白具有破壞纖維素高級(jí)結(jié)構(gòu)，協(xié)同纖維素酶水解纖維素的特點(diǎn)。為使膨脹素在協(xié)同反應(yīng)過(guò)程中盡可能發(fā)揮作用，本試驗(yàn)對(duì)協(xié)同反應(yīng)外在條件進(jìn)行初步研究。協(xié)同作用在反應(yīng)1 h時(shí)便有還原糖產(chǎn)生，36h時(shí)明顯增多，若反應(yīng)時(shí)間再延長(zhǎng)，纖維素酶減少，活性下降，對(duì)濾紙水解效率不會(huì)有所幫助。由于蛋白質(zhì)受pH影響，因此協(xié)同反應(yīng)活性也受pH影響，pH 4.0和pH 5.0時(shí)，DNS法測(cè)得濾紙被分解后產(chǎn)生還原糖量較高，pH 5.0時(shí)協(xié)同活性最高，而過(guò)酸和堿性條件都不利于協(xié)同反應(yīng)，也不利于還原糖產(chǎn)生。30～50℃時(shí)，產(chǎn)生還原糖量明顯增多，50℃時(shí)還原糖含量最高，當(dāng)協(xié)同反應(yīng)溫度達(dá)70℃時(shí)測(cè)得的還原糖含量顯著下降?？赡苡捎诜磻?yīng)溫度過(guò)高使纖維素酶發(fā)生熱變性，失去水解纖維素的作用。目前對(duì)膨脹素協(xié)同纖維素酶的條件研究較少，除外因的影響還可能存在內(nèi)在因素的作用，但具體的影響機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

本研究以黃瓜D0462為基因供體，成功克隆膨脹素基因Cs-EXPA1并構(gòu)建畢赤酵母組成型表達(dá)載體pGAPHαM-EXPA1，電擊轉(zhuǎn)入畢赤酵母中獲得工程菌，成功誘導(dǎo)膨脹素蛋白表達(dá)，通過(guò)對(duì)膨脹素協(xié)同作用的研究初步確定協(xié)同反應(yīng)各外界因素的最佳值，膨脹素蛋白與纖維素酶協(xié)同反應(yīng)36 h時(shí)產(chǎn)生的還原糖含量最多，膨脹素蛋白與纖維素酶協(xié)同反應(yīng)最適pH 4.0～5.0；最適溫度50℃。本文利用葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算酶反應(yīng)過(guò)程所釋放的還原糖量，初步確定纖維素酶和膨脹素蛋白協(xié)同反應(yīng)的最適條件，可為高效水解纖維素材料提供理論參考。

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