張會(huì)凱， 張曉煒， 王 珊， 翟留玉， 郭曉光， 張國華， 蔣國卿

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是老年人常見的神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病，臨床表現(xiàn)為進(jìn)行性認(rèn)知功能障礙、記憶力減退及行為異常等，老年斑、神經(jīng)纖維纏結(jié)和神經(jīng)元減少是AD的主要病理改變。p38 MAPK信號通路可由紫外線、滲透壓變化、細(xì)胞因子和生理應(yīng)激等激活，在應(yīng)激反應(yīng)如炎癥、細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要作用［1］，因此抑制p38 MAPK信號通路的活性、抑制炎癥因子的過度表達(dá)、降低tau蛋白的過度磷酸化有可能成為治療AD的有效方法。本研究通過觀察丁苯酞對AD模型大鼠行為學(xué)改變及大鼠海馬組織p38 MAPK、tau蛋白的表達(dá)的影響，探討其對AD的治療作用及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和分組 采用健康清潔級雄性SD大鼠，體重為250±50g，月齡4個(gè)月，由河北醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。按隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為空白組、模型組、丁苯酞低劑量組和丁苯酞高劑量組，每組8只。所有大鼠均在通風(fēng)、避光、自由進(jìn)食的條件下飼養(yǎng)。

1.2 動(dòng)物模型的制作 10%水合氯醛(0.4 ml/100g)腹腔注射麻醉后，固定于大鼠大腦立體定位儀上，參照包新民《大鼠腦立體定位圖譜》定位，采用微量注射器雙側(cè)海馬緩慢注射凝聚態(tài)Aβ1-42各5μl(1μg/μl)誘導(dǎo) AD 模型。

1.3 主要藥物和試劑 丁苯酞由石藥集團(tuán)恩必普藥業(yè)公司提供(批號118120213)，用食用麻油稀釋成8mg/ml的溶液，于4℃冰箱保存?zhèn)溆茫鶕?jù)人和動(dòng)物按體表面積折算的等效劑量［2］，高劑量組按80mg/kg灌胃、低劑量組按40mg/kg灌胃，空白組、模型組均給以等體積的食用麻油灌胃，每日2次，所有動(dòng)物均在造模2w后開始藥物干預(yù)，藥物干預(yù)共4w。

Aβ1-42(美國Sigma公司)，β-actin單克隆抗體(美國Sigma公司)，tau單克隆抗體(美國Bioworld公司)及P-tau蛋白單克隆抗體(美國Bioworld公司)，p38 MAPK單克隆抗體(美國Cell Signaling公司)及磷酸化P38MAPK單克隆抗體(美國Cell Signaling公司)。

1.4 觀察指標(biāo)

1.4.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物行為學(xué)檢測 Morris水迷宮［3］是一個(gè)直徑為200cm、深60cm的圓形水箱，平均分成4個(gè)象限，水面下2cm處有一個(gè)直徑為9cm的平臺(tái)，平臺(tái)位于其中1個(gè)象限的中心。造模1w后及藥物干預(yù)4w后分別進(jìn)行水迷宮實(shí)驗(yàn)，前5d進(jìn)行定位航行實(shí)驗(yàn)，記錄大鼠從4個(gè)不同象限入水至爬上平臺(tái)的時(shí)間(s)，即逃避潛伏期，如果在120s內(nèi)未能發(fā)現(xiàn)平臺(tái)，將其引至平臺(tái)停留10s，這個(gè)象限記為120s，上午和下午各進(jìn)行1次，每日2次4個(gè)象限的平均值記為大鼠當(dāng)日的結(jié)果。第6天撤除平臺(tái)，記錄60s內(nèi)大鼠游過原平臺(tái)的次數(shù)，每日2次，取2次的平均值作為大鼠游過平臺(tái)的次數(shù)。

1.4.2 大鼠腦片HE染色 10%水合氯醛腹腔注射麻醉，暴露心臟，經(jīng)心尖處穿刺至升主動(dòng)脈，同時(shí)剪開右心耳，0.01mol PBS灌注至流出液為澄清時(shí)改為4%多聚甲醛灌注約30min，迅速斷頭取腦，于4%多聚甲醛中固定24h，常規(guī)冠狀切片，厚度為10μm，經(jīng)蘇木色精染液，伊紅染液，酒精梯度脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。

1.4.3 p38 MAPK的表達(dá) 10%水合氯醛腹腔注射麻醉后，斷頭低溫分離海馬組織，微波勻漿，低溫10000轉(zhuǎn)/分離心，取上清即為全蛋白提取物，BCA法測蛋白濃度，經(jīng)10%SDS-PAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)印至 PVDF膜上，封閉后分別用 β-actin、tau、P-tau、p38 MAPK及P-p38 MAPK抗體4℃水平搖床過夜，二抗室溫下?lián)u床孵育1h，洗膜后利用Gel Doc凝膠成像系統(tǒng)掃膜分析得出 β-actin、tau、P-tau、p38 MAPK及P-p38 MAPK的灰度值，計(jì)算出P-tau與tau、P-p38 MAPK與p38 MAPK灰度值的比值表示P-tau、P-p38 MAPK 水平;tau、p38 MAPK 與相應(yīng)的β-actin灰度值的比值表示tau、p38 MAPK水平。

1.4.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件處理，數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，各組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。非正態(tài)或方差不齊者各組間比較采用Kruskal-Wallis H檢驗(yàn)，組間兩兩比較采用Games-Howell檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn):α＜0.05。

2 結(jié)果

2.1 行為學(xué)檢測結(jié)果 造模1w后，4組大鼠逃避潛伏期、穿越平臺(tái)次數(shù)不同(P＜0.05)。與空白組比較，模型組和丁苯酞低、高劑量組逃避潛伏期時(shí)間明顯延長(P＜0.05)，穿越平臺(tái)次數(shù)明顯減少(P＜0.05)。藥物干預(yù)4w后，4組大鼠逃避潛伏期、穿越平臺(tái)次數(shù)不同(P＜0.05)。與模型組比較，丁苯酞低、高劑量組逃避潛伏期時(shí)間縮短(P＜0.05)，穿越平臺(tái)次數(shù)增多(P＜0.05);與低劑量組比較，高劑量組逃避潛伏期時(shí)間縮短(P＜0.05)，穿越平臺(tái)次數(shù)增多(P＜0.05)(見表1)。

2.2 大鼠海馬組織tau蛋白、p38 MAPK蛋白的表達(dá) tau、p38 MAPK在4組大鼠中表達(dá)水平無明顯變化(P ＞0.05)，P-tau、P-p38 MAPK 在 4組大鼠中表達(dá)水平不同(P＜0.05)。與空白組比較，模型組和丁苯酞低、高劑量組P-tau、P-p38 MAPK表達(dá)升高(P＜0.05)。與模型組比較，丁苯酞低、高劑量組P-tau、P-p38 MAPK 表達(dá)降低(P ＜0.05)。與低劑量組比較，高劑量組P-tau、P-p38 MAPK表達(dá)明顯降低(P ＜0.05)(見表2、圖1)。

2.3 大鼠海馬組織CA1區(qū)HE染色(100倍)空白組大鼠海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞排列緊密規(guī)則，未見明顯的細(xì)胞壞死;模型組大鼠海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞明顯疏松，層次模糊，大量神經(jīng)細(xì)胞死亡;丁苯酞低劑量組可見部分錐體細(xì)胞壞死，排列比較規(guī)則;丁苯酞高劑量組錐體細(xì)胞壞死較少，排列基本規(guī)則(見圖2)。

表1 藥物干預(yù)前、干預(yù)4w后Morris水迷宮試驗(yàn)結(jié)果(±s)

表1 藥物干預(yù)前、干預(yù)4w后Morris水迷宮試驗(yàn)結(jié)果(±s)

與空白組比較*P＜0.05;與模型組比較#P＜0.05;與低劑量組比較△P＜0.05

組別 例數(shù) 藥物干預(yù)前逃避潛伏期(s)穿越平臺(tái)次數(shù)藥物干預(yù)4w后逃避潛伏期(s)穿越平臺(tái)次數(shù)空白組模型組低劑量組高劑量組8 8 8 8 43.940 ±4.032 80.380 ±6.775*77.380 ±6.510*78.680 ±8.878*5.550 ±1.141 3.900 ±0.907*4.150 ±0.784*3.850 ±1.001*46.349 ±5.227 83.337 ±6.009 65.720 ±6.307#50.367 ±7.301#△5.783 ±1.302 3.747 ±0.874 4.551 ±0.820#5.347 ±0.960#△

表2 大鼠海馬tau、p38 MAPK灰度比值(±s)

表2 大鼠海馬tau、p38 MAPK灰度比值(±s)

與空白組比較*P ＞0.05，#P ＜0.05;與模型組比較△P ＜0.05;與低劑量組比較▽P ＜0.05

組別tau P-tau p38 MAPK P-p38 MAPK空白組模型組低劑量組高劑量組0.805 ±0.372 0.794 ±0.397*0.736 ±0.401*0.820 ±0.433*0.197 ±0.034 0.499 ±0.047#0.325 ±0.038#△0.231 ±0.036#△▽0.828 ±0.408 0.874 ±0.428*0.921 ±0.519*0.947 ±0.541*0.180 ±0.049 0.517 ±0.052#0.362 ±0.046#△0.252 ±0.051#△▽

圖1 丁苯酞對tau、p38 MAPK表達(dá)的影響

3 討論

p38 MAPK信號通路是MAPK通路的一個(gè)重要分支，通過參與炎癥反應(yīng)、tau蛋白過磷酸化、促神經(jīng)元凋亡等與其他信號傳遞途徑共同介導(dǎo)細(xì)胞應(yīng)激誘發(fā)的基因表達(dá)和酶活性改變，在AD發(fā)病、進(jìn)展中發(fā)揮重要作用［4］。Cui L［5］等發(fā)現(xiàn)腦缺血大鼠海馬組織p38 MAPK明顯升高，并且有大量神經(jīng)細(xì)胞凋亡，通過抑制p38 MAPK通路，缺血大鼠區(qū)神經(jīng)元凋亡明顯減少。老年斑和神經(jīng)原纖維纏結(jié)是AD的兩大特征性損害，越來越多的研究證實(shí)，Aβ在體內(nèi)外誘導(dǎo)tau蛋白過度磷酸化，破壞微管結(jié)構(gòu)及穩(wěn)定性，損傷軸突轉(zhuǎn)運(yùn)，最終引起神經(jīng)元死亡［6］。

丁苯酞能夠改善微循環(huán)、維護(hù)線粒體的結(jié)構(gòu)和功能、降低腦缺血皮層calcineurin和calpain的活性，從而阻止神經(jīng)細(xì)胞凋亡的啟動(dòng)，減輕腦缺血對AD發(fā)展的推動(dòng)作用，改善AD大鼠的認(rèn)知功能［7］。在實(shí)驗(yàn)中丁苯酞低、高劑量組P-p38 MAPK的表達(dá)比模型組明顯降低，并且呈現(xiàn)出劑量相關(guān)性，隨著丁苯酞?jiǎng)┝康募哟?，表達(dá)隨之降低，表明丁苯酞明顯抑制了p38 MAPK的活性。長期慢性缺血缺氧導(dǎo)致大量炎癥因子產(chǎn)生，p38 MAPK被磷酸化，移位入核作用到相應(yīng)的目標(biāo)，激活下游多種轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄，誘導(dǎo)Bax轉(zhuǎn)位，介導(dǎo)caspase-3活化，上調(diào)TNF-α的表達(dá)，促使細(xì)胞凋亡［8］。另外磷酸活化的p38 MAPK進(jìn)一步使IL-1、TNF-α等炎癥因子活化，直接損傷神經(jīng)元，而炎性因子反過來又強(qiáng)烈激活 p38 MAPK通路，形成一個(gè)逐漸增強(qiáng)的炎癥正反饋途徑［9］?，F(xiàn)已證明:老年斑的核心成分就是 Aβ。AD患者腦部存在慢性低灌注，長期缺血缺氧、線粒體發(fā)生功能障礙、促進(jìn)炎癥因子的釋放、引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)損傷、誘導(dǎo)β淀粉樣蛋白的異常形成。隨著β淀粉樣蛋白沉積量的增加，iNOS表達(dá)增高，p38 MAPK被磷酸活化，引起NO的高表達(dá)［10］。另外，大量活化的NF-κB，上調(diào)COX-2的表達(dá)，導(dǎo)致突觸減少、神經(jīng)元缺損、誘導(dǎo)海馬神經(jīng)元的凋亡，最終導(dǎo)致記憶及認(rèn)知功能障礙［11］。實(shí)驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn):模型組P-tau表達(dá)最高，低劑量組較模型組降低，高劑量組下降最明顯，隨著藥物劑量的增加表達(dá)逐漸下降。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)Aβ可通過GSK-3β途徑增加tau蛋白異常磷酸化，從而引起tau蛋白介導(dǎo)的神經(jīng)退行性變。此外tau蛋白的過磷酸化是由蛋白激酶完成的，而MAPK是調(diào)節(jié)tau蛋白過度磷酸化的關(guān)鍵性激酶之一。p38 MAPK是MAPK的重要家族組成部分［12］，因此p38 MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑可能參與了早期SP的形成，Aβ在大腦中的過量生成和聚集，使p38 MAPK磷酸化，進(jìn)一步促進(jìn)tau的過磷酸化，繼而出現(xiàn)中樞整合功能異常。

通過抑制p38 MAPK的活性，一方面抑制其對促炎信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)作用;另一方面抑制其作為炎性細(xì)胞因子的下游信號中繼而介導(dǎo)的炎癥引發(fā)的有害效應(yīng)，減輕小膠質(zhì)細(xì)胞引起的炎性反應(yīng)，降低tau蛋白的異常磷酸化及IL-1、TNF-α等炎癥因子的表達(dá)，從而發(fā)揮其改善AD大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的作用［13］。因此，丁苯酞可能會(huì)成為臨床治療AD的新藥物，可以通過抑制p38 MAPK的活性來減輕Aβ誘導(dǎo)的tau蛋白過度磷酸化，但是具體通過何種途徑抑制 p38 MAPK的活性從而減輕tau蛋白磷酸化。目前尚不清楚，具體機(jī)制還需要更深入的研究。

圖2 大鼠海馬組織CA1區(qū)HE染色(100倍)

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