李 豐 碩，李 代，薛 永 常

(1.大連工業(yè)大學 生物工程學院，遼寧 大連 116034；2.遼寧省大連海洋漁業(yè)集團公司，遼寧 大連 116113)

0 引 言

羅布麻有“野生纖維之王”之稱，纖維含量極高，化學抗性好、延伸率低、結構緊密，有良好的醫(yī)療保健作用，日益在紡織行業(yè)得到高度關注。羅布麻纖維脫膠方法及脫膠深度直接影響其后續(xù)加工。傳統(tǒng)的化學脫膠處理時間長，污染環(huán)境，消耗能源較大；生物脫膠具有脫膠周期短、纖維產量高、品質好和環(huán)境污染輕等特點[1]，薛衛(wèi)巍等[2]篩選出一株高效羅布麻脫膠菌種，翟秋梅等[3]將該菌種用于羅布麻生物脫膠，效果明顯。作者采用交聯(lián)酶聚集體技術[4]對枯草芽孢桿菌FM208849所產的對羅布麻脫膠具有特異性作用的果膠酶進行固定化，在提高果膠酶在脫膠過程中的穩(wěn)定性和高效性[5]的基礎上，對果膠酶CLEAs的制備條件進行了初步研究，并對其在羅布麻皮的脫膠效果進行了探討。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

枯草芽孢桿菌(BacillussubtilisFM208849，S－1)，本實驗室分離保存。羅布麻(Apocynum venetumL.)，采自青海柴達木盆地。牛血清白蛋白，Roche產品；果膠，Sigma公司。

種子培養(yǎng)基[4]：牛肉膏3g／L，蛋白胨10g／L，NaCl 5g／L，pH 7.0，121℃滅菌20min。

發(fā)酵培養(yǎng)基[4]：果膠1g／L，葡萄糖3g／L，牛肉膏15g／L，NaCl 2g／L，121℃滅菌20min。

1.2 實驗方法

1.2.1 交聯(lián)果膠酶聚集體制備條件的確定

游離果膠酶的制取參考文獻[6]，果膠酶活力測定采用DNS法[7]，蛋白含量測定采用Bradford法[8]，脫膠殘膠率測定參考文獻[9]，對交聯(lián)果膠酶聚集體制備影響因素進行研究，通過測定果膠酶活力確定其交聯(lián)條件。

1.2.2 交聯(lián)果膠酶聚集體對羅布麻脫膠應用

將制備好的交聯(lián)果膠酶聚集體用pH 9.5的Na2CO3－NaHCO3緩沖溶液配制成10mg／mL懸浮液，取不同的體積分別與制備好的漚麻液(含羅布麻皮1g)在45℃水浴中進行脫膠反應，脫膠10h后將殘留的羅布麻皮用清水沖洗、烘干，測定其殘膠率。在交聯(lián)果膠酶聚集體的最佳脫膠時間的確定中，分別進行1、2、3、4、5、6、7、8、9、10h的脫膠反應，反應完成后測定羅布麻皮的殘膠率。在考察交聯(lián)果膠酶聚集體的操作穩(wěn)定性時，每次脫膠完成后，將交聯(lián)果膠酶聚集體離心、洗滌進行重復脫膠實驗，共進行10次脫膠檢測。

2 結果與分析

2.1 交聯(lián)果膠酶聚集體交聯(lián)條件確定

2.1.1 戊二醛體積分數(shù)

如圖1所示，當戊二醛體積分數(shù)達到4%時相對酶活回收率達到最大值。戊二醛含有雙功能基團，既是酶的交聯(lián)劑，同時也是酶蛋白的變性劑，低濃度的戊二醛溶液易于果膠酶聚集體交聯(lián)完全，而高濃度的戊二醛能使蛋白質變性。綜合考慮，選擇戊二醛溶液體積分數(shù)為4%。

圖1 戊二醛體積分數(shù)對交聯(lián)果膠酶聚集體酶活力的影響Fig.1 Effects of glutaradehyde concentrations on pectinase CLEAs activity

2.1.2 果膠酶聚集體交聯(lián)溫度

交聯(lián)溫度的改變對CLEAs活力回收率的影響如圖2所示。當交聯(lián)溫度較低時，果膠酶CLEAs的活力回收率較高，30℃達到最大值；溫度繼續(xù)升高，CLEAs的活力損失較為嚴重，60℃時，CLEAs的活力回收率僅為15%左右，因此選擇制備CLEAs交聯(lián)溫度為30℃。

圖2 溫度對交聯(lián)果膠酶聚集體酶活力的影響Fig.2 Effect of cross－linked temperature on pectinase CLEAs activity

2.1.3 果膠酶聚集體交聯(lián)時間

將2mL的4%的戊二醛溶液緩慢滴加到制備好的果膠酶聚集體的懸浮液中，定時取樣，計算果膠酶CLEAs的活力回收率。圖3所示果膠酶CLEAs的酶活回收率隨著交聯(lián)時間的逐漸延長而增大，當交聯(lián)時間為135min時，CLEAs的酶活回收率最大，達到61.5%，隨著時間的繼續(xù)增加，酶活回收率開始慢慢下降，因而確定交聯(lián)果膠酶聚集體的最佳交聯(lián)時間為135min。

圖3 交聯(lián)時間對果膠酶聚集體酶活力的影響Fig.3 Effects of crosslinking time on pectinase CLEAs activity

2.2 交聯(lián)果膠酶聚集體對羅布麻的脫膠效果

2.2.1 羅布麻脫膠的交聯(lián)果膠酶聚集體體積質量的確定

20mL漚麻液(含羅布麻皮1g)與不同體積的10mg／mL交聯(lián)果膠酶聚集體進行脫膠反應，脫膠效果如圖4所示。隨著交聯(lián)果膠酶聚集體含量的增加，羅布麻皮的殘膠率顯著下降，當CLEAs體積質量達到2.5mg／mL時，羅布麻皮的殘膠率降至最低僅為4.55%，而當CLEAs的用量大于2.5mg／mL時，羅布麻的殘膠率不再有明顯下降。因而1g羅布麻皮脫膠所需的交聯(lián)果膠酶聚集體為50mg，殘膠率為4.55%。

圖4 交聯(lián)果膠酶聚集體的體積質量對羅布麻脫膠效果的影響Fig.4 Effect of CLEAs content on apocynum degumming

2.2.2 交聯(lián)果膠酶聚集體的最佳脫膠時間

50mg交聯(lián)果膠酶聚集體與20mL漚麻液在45℃條件下進行脫膠反應，不同脫膠時間的羅布麻皮中殘膠率的結果如圖5所示。在脫膠反應進行8h后，羅布麻皮中的殘膠率趨于平衡，不再降低，因此，交聯(lián)果膠酶聚集體與漚麻液在45℃下進行脫膠反應的最佳時間為8h，羅布麻皮的殘膠率可降至4.61%。

圖5 脫膠時間對羅布麻脫膠效果的影響Fig.5 Effect of degumming time for apocynum degumming

2.2.3 交聯(lián)果膠酶聚集體脫膠的操作穩(wěn)定性

對50mg的交聯(lián)酶聚集體與20mL漚麻液(含羅布麻皮1g)在45℃下進行共10次重復脫膠反應，結果如表1。在經過10次的羅布麻脫膠實驗后，還能保證羅布麻的殘膠率在11.25%以下，說明交聯(lián)果膠酶聚集體的操作穩(wěn)定性較好。

表1 交聯(lián)果膠酶聚集體操作穩(wěn)定性Tab.1 Operation stability of CLEAs

3 結 論

以體積分數(shù)為4%的戊二醛作為交聯(lián)劑，30℃水浴中交聯(lián)135min得到的交聯(lián)果膠酶聚集體果膠酶活性最高。利用5mL的10mg／mL的交聯(lián)果膠酶聚集體對羅布麻皮脫膠8h，可將其殘膠率降至4.61%。將果膠酶CLEAs進行10次羅布麻皮脫膠實驗后，殘膠率降至11.25%，說明其可重復利用率較高。

[1]鮑明東，陳卓，劉自镕，等.羅布麻生物脫膠研究初報[J].山東農業(yè)科學，2002(6)：11－13.

[2]薛衛(wèi)巍，薛永常，翟秋梅，等.適于羅布麻生物脫膠的果膠酶產生菌分離篩選與表征[J].工業(yè)微生物，2009，39(2)：55－58.

[3]翟秋梅，薛永常，薛衛(wèi)巍，等.羅布麻酶法脫膠初探[J].食品與生物技術學報，2011，30(1)：118－123.

[4]CAO L，van RANTWIJK F，SHELDON R A.Cross－linked enzyme aggregates：A simple and effective method for the immobilization of penicillin acylase[J].Organic Letters，2000，2(10)：1361－1364.

[5]翟秋梅，薛衛(wèi)巍，薛永常，等.枯草芽孢桿菌FM208849產果膠酶發(fā)酵條件的優(yōu)化[J].大連工業(yè)大學學報，2010，29(2)：93－97.(ZHAI Qiu－mei，XUE Wei－wei，XUE Yong－chang，et al.The optimization of pectinase fermentation fromBacillussubtilisFM208849[J].Journal of Dalian Polytechnic University，2010，29(2)：93－97.)

[6]李豐碩，張燦，薛永常，等.枯草芽孢桿菌FM208849產果膠酶的固定化及酶學性質研究[J].生物技術通報，2012(6)：141－146.

[7]張飛，岳田利，費堅，等.果膠酶活力的測定方法研究[J].西北農業(yè)學報，2004，13(4)：134－137.

[8]袁道強，黃建華.生物化學實驗和技術[M].北京：中國輕工業(yè)出版社，2005：184－188.

[9]薛衛(wèi)巍，翟秋梅，薛永常，等.羅布麻微生物脫膠工藝優(yōu)化[J].紡織學報，2009，30(4)：80－84.