錢巧芬，張珊珊，侯 靜，吳 琪，盧神州

(1.蘇州大學(xué)紡織與服裝工程學(xué)院，江蘇蘇州215123;2.南通蘇州大學(xué)紡織研究院，江蘇蘇州215123)

幾個世紀(jì)以來，蠶絲作為一種紡織材料，因其特殊的光澤和良好的機械性能而廣為人知［1］。蠶絲能被溴化鋰、硫氰酸鋰、硫氰酸鈣、氯化鈣等的濃溶液溶解［2］，從而加工成其他形態(tài)的材料，如直徑為微米級和納米級的絲素纖維、絲素膜、絲素水凝膠、多孔材料、球狀骨針、膠囊等［3］。一般認為，絲素蛋白除了無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)，還存在SilkⅠ和SilkⅡ兩種結(jié)晶結(jié)構(gòu)。研究表明，濕熱法、有機溶劑法和拉伸處理法能夠促使絲素蛋白從無規(guī)卷曲向β-折疊結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變［4］，最終使得絲素蛋白材料不溶于水。得益于其良好的生物相容性，很多種類的細胞能在絲素膜上生長［5］。人角膜內(nèi)皮細胞可以在絲素膜上生長，表明絲素膜可以用于角膜移植［6］。人角膜成纖維細胞在絲素膜及絲素多孔材料上培養(yǎng)結(jié)果表明，絲素蛋白材料對角膜組織的修復(fù)有重大的利用價值［7］。但是絲素溶液直接澆鑄在基質(zhì)上，待液體揮發(fā)并最終轉(zhuǎn)變?yōu)楣滔?，得到的絲素膜脆性較大，強度不夠，且易溶于水［8］，使其應(yīng)用于角膜的修復(fù)受到限制。因此，如何改善絲素蛋白膜的水溶性及透明性，使其更加符合人角膜移植的要求是目前角膜組織修復(fù)的一個熱點。目前有些文獻采用絲素蛋白與其他化合物或天然高聚物共混合來改善其水溶性及生物相容性［9］。絲素蛋白溶液與山梨醇或肌醇共混，可以制備出不溶于水的透明絲素膜［10］，但是兩種共混膜只能在干態(tài)下保持較好的透光率，在濕態(tài)時透光率不理想，使其在角膜修復(fù)工程上的應(yīng)用受到了限制。因此，需要尋求一種醇類化合物，在將其與絲素蛋白混合后，共混膜在干、濕態(tài)都能保持良好的透光率。

將一定比例的聚乙二醇混入絲素膜可使膜在保持原有良好生物性質(zhì)前提下改善膜的柔韌性，且透光性較好，但因其聚合物相對分子量較大，故與絲素的可混性稍差［11］。因此，本文考慮采用相對分子量較小的乙二醇，與絲素共混的方法制得絲素蛋白透明共混膜，對其結(jié)構(gòu)和性能進行了研究，并在其上培養(yǎng)L929細胞，研究其生物相容性。

1 試驗與方法

1.1 絲素蛋白共混膜的制備

家蠶生絲置于質(zhì)量分數(shù)為0.05%的Na2CO3溶液中，于98～100℃處理30 min，重復(fù)3次，脫去生絲中的絲膠。洗凈干燥后的純絲素纖維在65℃下溶解于9.3 mol/L的溴化鋰溶液中，透析3 d后過濾得到純絲素溶液。

取40 mL絲素溶液，按乙二醇/絲素質(zhì)量分數(shù)分別為 0︰10、1︰10、2︰10、3︰10、4︰10、5︰10、6︰10 的比例向絲素溶液中加入相應(yīng)質(zhì)量的乙二醇，混合均勻后倒入聚苯乙烯塑料模具中，在室溫下于通風(fēng)櫥中風(fēng)干即得共混膜。

1.2 結(jié)構(gòu)表征

使用全自動X'PERT PRO MPD射線衍射儀(荷蘭帕納科公司)，CuKα射線，在管電壓40 kV﹑管電流35 mA﹑掃描速度10°/min的條件下，記錄得到2θ=5°～45°的衍射強度曲線。用Nicolet 5700 FI-IR型傅立葉變換紅外光譜儀測試，將共混膜加工成直徑小于80 μm的粉末后，KBr壓片制樣，測試4 000～400 cm-1吸光度得到共混膜的紅外吸收光譜。

1.3 溶失率測定

將共混膜在恒溫恒濕(25℃，相對濕度65%)下平衡24 h，每個稱取質(zhì)量W1(g)的樣品3塊，然后在烘箱中105℃烘至恒重。稱重得到W2(g)。含水率C的計算公式:

將共混膜在恒溫恒濕(25℃，相對濕度65%)環(huán)境中平衡24 h，然后準(zhǔn)確稱取0.1 g左右的樣品W1，放入錐形瓶中，按浴比1︰100加入去離子水，37℃水浴預(yù)熱30 min后在37℃的水浴恒溫震蕩器中震蕩24 h，然后取出溶液。用Smartspec型紫外分光光度計測出溶液在278 nm下的吸光度A。共混膜的絲素蛋白溶失率D計算公式:

式中:K為絲素溶液的紫外吸光常數(shù)，K=1.102 6。

剩下的絲素膜固體用去離子水沖洗3遍后放入105℃烘箱中烘干得W2。共混膜的質(zhì)量溶失率Z計算公式:

1.4 力學(xué)性能測試

使用美國Instron3365型萬能材料試驗機進行測試，拉伸速度為20 mm/min，夾距為28 mm，試樣是按照GB/T1040—2006標(biāo)準(zhǔn)工字3型刀具壓出的樣條。測試干態(tài)強力前將樣條在恒溫恒濕(25℃，相對濕度65%)中平衡24 h;濕態(tài)強力測試則是將樣品于生理鹽水中浸泡24 h后，取出擦干測定。

1.5 透光率測定

將共混膜平鋪置于24孔板板底，用酶標(biāo)儀(BIO-TEK SYNERGY)分別測定 492、550 nm及700 nm處的吸光度值(A)。干態(tài)透光率直接鋪板測定。測試濕態(tài)下的透光率時，先將膜在去離子水中浸泡24 h，再將其平鋪于培養(yǎng)板底，加入1 mL去離子水進行測試。不同波長下各檢測4個孔，取平均值。透光率T計算公式:

1.6 降解性

選取質(zhì)量分數(shù)為30%的乙二醇共混膜分別用tris緩沖溶液和蛋白酶-ⅩⅣ溶液降解，對照樣為用體積分數(shù)75%乙醇浸泡2 h的純絲素膜。將兩種材料于去離子水中浸泡72 h后取出，干燥后稱取降解樣品0.1 g置入離心管中，按浴比1︰100分別向其中加入10 mL的tris緩沖溶液，2 U/mL的蛋白酶ⅩⅣ溶液，放置于37℃的水浴恒溫震蕩器中降解，每兩天換液一次。分別于第1、3、6、9、12、15 d 取出樣品，每個時間點重復(fù)3次，用去離子水充分洗滌后干燥并稱重，計算出失重率，將第3 d的樣品制成粉末用于X射線衍射。

1.7 細胞相容性

將含乙二醇質(zhì)量分數(shù)為30%的絲素溶液直接加入24孔板風(fēng)干成膜，對照樣為經(jīng)體積分數(shù)75%乙醇處理過的純絲素膜。取處于對數(shù)生長期的L929細胞，胰酶消化后用完全培養(yǎng)基制成細胞懸液，調(diào)整細胞濃度為1×105個/mL，每孔加入1 mL細胞懸液，兩種材料各重復(fù)4孔，置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。分別于接種后1、3、5 h計數(shù)未黏附的細胞數(shù)，計算細胞的黏附率。取處于對數(shù)生長期的L929細胞，胰酶消化后用完全培養(yǎng)基制成細胞懸液，調(diào)整細胞濃度為2×104個/mL，每孔加入200 μL細胞懸液，兩種材料各重復(fù)6孔，置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔天換液。分別于 1、3、5、7、9 d，每孔加入20 μL摩爾濃度為50 μmol/L的樹脂天青溶液，并于培養(yǎng)箱中孵育6 h;在酶標(biāo)儀上測定其熒光強度(FLU 值，激發(fā)波長530 nm，發(fā)射波長 590 nm)［12］，測定細胞增殖率。

2 結(jié)果與分析

2.1 絲素蛋白膜的結(jié)構(gòu)

乙二醇/絲素共混膜的X衍射曲線和紅外光譜圖分別如圖1(a)和圖1(b)所示。由圖1(a)中可以看出純絲素膜主要以無定形結(jié)構(gòu)為主，曲線b～g均在 12.2°、19.7°、24.7°、28.2°、32.3°、36.8°處有衍射峰出現(xiàn)，這說明乙二醇主要是誘導(dǎo)絲素蛋白由無規(guī)結(jié)構(gòu)向Silk I結(jié)晶結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變;另外當(dāng)乙二醇/絲素質(zhì)量比為 5/10、6/10(圖中的 f，g)時，2θ在 9.1°出現(xiàn)了Silk II的衍射峰，說明隨著乙二醇濃度的升高，逐漸形成Silk II型結(jié)晶結(jié)構(gòu)。

圖1 絲素蛋白共混膜的結(jié)構(gòu)Fig.1 Structure of blend silk fibroin membranes

由圖1(b)可以看出，純絲素膜的紅外吸收峰在1 651.5 cm-1(酰 胺 I)，1 542 cm-1(酰 胺 II)，1 244 cm-1(酰胺 III)，屬于無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)［13］。乙二醇/絲素質(zhì)量比為1/10、2/10、3/10(圖中的 b，c，d)時，共混膜中的絲素蛋白在酰胺I、酰胺II、酰胺III區(qū)的吸收峰均在1 653.8、1 541.9、1 242 cm-1附近，與純絲素膜的吸收峰位置相近，由于在紅外譜圖上難以區(qū)分α螺旋與無規(guī)卷曲，結(jié)合前面的X射線衍射結(jié)果，可以得出這3種比例的乙二醇/絲素共混膜中的絲素蛋白均為α螺旋構(gòu)象。當(dāng)乙二醇/絲素質(zhì)量比為4/10、5/10(圖中的 e，f)時，共混膜在酰胺 I、酰胺 II區(qū)的吸收峰變寬;繼續(xù)增加乙二醇的濃度，共混膜逐漸在1 629 cm-1處出現(xiàn)新的吸收峰，1 653.8 cm-1處的吸收峰也逐漸變?nèi)酰@說明，當(dāng)乙二醇/絲素質(zhì)量比超過4/10時，共混膜中的α螺旋構(gòu)象逐漸減少，β折疊構(gòu)象逐漸增多。

由此可知，當(dāng)乙二醇濃度較低時，其主要促進絲素蛋白由無規(guī)結(jié)構(gòu)向Silk I結(jié)晶結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變，而當(dāng)乙二醇/絲素為6/10時，有部分絲素蛋白向Silk II結(jié)晶結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變。

3.2 溶失率

乙二醇/絲素共混膜的熱水溶失率如圖2所示。在圖2(a)中可以看出，乙二醇質(zhì)量分數(shù)為10%時，共混膜的絲素蛋白溶失率就從純絲素膜的90%降至5%以下，繼續(xù)增加乙二醇的含量，絲素蛋白的溶失率幾乎不變。因此可知，當(dāng)加入的乙二醇的質(zhì)量占絲素蛋白質(zhì)量的10%時，絲素膜就開始不溶，故可以通過將乙二醇與絲素蛋白共混解決絲素蛋白的水溶性問題。

在圖2(b)中，乙二醇質(zhì)量分數(shù)為10%時，共混膜中的乙二醇幾乎全部溶出，隨著乙二醇濃度的升高，共混膜的質(zhì)量損失率呈緩慢上升趨勢，當(dāng)乙二醇/絲素質(zhì)量比為6/10時，質(zhì)量損失率約為20%，故可知共混膜中的乙二醇還有部分未溶出。

圖2 絲素蛋白膜的溶失率Fig.2 Dissolve-loss rate of silk fibroin membranes

3.3 力學(xué)性能

乙二醇/絲素共混膜在干態(tài)和濕態(tài)下的力學(xué)性能如圖3所示。在干態(tài)下，共混膜的強度隨著乙二醇含量的增加而下降，應(yīng)變則隨著乙二醇含量的增加先增大后減小，這說明乙二醇對絲素蛋白起到增塑作用。同時可以看出，當(dāng)乙二醇質(zhì)量分數(shù)為30%時，共混膜柔韌性最好，所以可以通過調(diào)控乙二醇的質(zhì)量分數(shù)來制備出所需的力學(xué)性能的絲素蛋白膜。

圖3 絲素蛋白膜的力學(xué)性能Fig.3 Mechanical property of silk fibroin membranes

從圖3(b)中可以看出，在濕態(tài)下，共混膜的強度隨著乙二醇質(zhì)量分數(shù)的增大而下降，伸長率變化的規(guī)律也是如此。

3.4 透光性

人眼角膜的透光率隨著波長的增加而上升，在450 nm處約為80%，在500 nm處接近90%，700 nm以上時透光率趨于穩(wěn)定約為95%［14］。干、濕態(tài)下的共混膜在450、500、700 nm波長下的透光率如圖4所示。由圖4(a)可以看出，在干態(tài)下，共混膜的透光率極好，均在90%以上，且乙二醇含量的增加對干態(tài)透光率影響不大。由圖4(b)可以看出，與干態(tài)相比，共混膜濕態(tài)透光率略有下降，但仍有著較高的透光率，且其透光率均在90%以上。由此可見，乙二醇絲素蛋白共混膜透光率接近人的角膜，可望用于人的眼角膜修復(fù)材料。

圖4 透明絲素蛋白膜的透光性Fig.4 Light transmission of transparent silk fibroin membranes

3.6 體外降解

乙二醇/絲素共混膜在蛋白酶XIV溶液中的降解情況如圖5所示。純絲素膜和乙二醇/絲素共混膜在tris緩沖溶液中幾乎不降解。從圖5(c)可以看出，純絲素膜在蛋白酶溶液中，質(zhì)量分數(shù)呈線性下降，在第15 d的時候，質(zhì)量分數(shù)下降至50%左右。共混絲素膜則在降解第1 d的時候，質(zhì)量分數(shù)就下降至35%左右，在第3 d時，下降至13%左右，最后在第6 d時幾乎全部降解，質(zhì)量分數(shù)還剩6%左右，之后質(zhì)量分數(shù)變化不明顯?？梢姷鞍酌竂IV對Silk I結(jié)構(gòu)的絲素膜降解作用較強。

圖5 絲素膜在降解過程中的質(zhì)量分數(shù)變化Fig.5 Weight changes of silk fibroin membranes during enzymatic degradation

3.7 細胞相容性

L929細胞在兩種絲素膜上的黏附率如圖6所示。從圖6可以得知，細胞在共混絲素膜上的黏附率較好，在1 h后就達到了80%以上，并隨著時間的增加繼續(xù)增加。通過SPSS軟件分析，乙二醇共混膜與純絲素膜的細胞黏附率無顯著性差異，但要優(yōu)于純絲素膜。

圖6 L929細胞在透明絲素膜上的黏附率Fig.6 Cell attachment of L929 cells on transparent silk fibroin membranes

圖7 L929細胞在不同材料上培養(yǎng)不同天數(shù)的生長形態(tài)Fig.7 Phase contrast light microscope images of L929 cells cultured different days on different silk fibroin membranes

用倒置相差顯微鏡觀察細胞的生長形態(tài)，如圖7所示。從圖7可以看出，第1 d時，細胞數(shù)目較少，不同材料間沒有明顯差異;第3 d時，細胞數(shù)目明顯增多，說明兩種材料增殖均較好，純絲素膜和共混膜上的細胞形態(tài)較好，細胞呈梭形、三角形以及多邊形，分散也較均勻;培養(yǎng)第5 d時，兩種材料上的細胞均鋪滿整個視野，并開始有圓縮細胞產(chǎn)生，細胞數(shù)目沒有明顯差異?？傮w看來，共混膜上的細胞不僅形態(tài)良好，且能夠很好地分散在膜上各處，說明共混膜能夠很好地支持細胞的生長。

FLU值的大小反應(yīng)了活細胞的數(shù)量，如圖8所示。從圖8可以看出，L929細胞在共混膜上的增殖較好，在第5d和第7d時，略好于純絲素膜。經(jīng)統(tǒng)計分析可知，兩者沒有顯著性差異。

圖8 L929細胞在不同材料上培養(yǎng)不同天數(shù)的FLU值Fig.8 Fluorescence value of L929 cells cultured different days on different silk fibroin membranes

由上可知，共混膜在黏附率和細胞增殖上與純絲素膜均沒有顯著性差異，但又略優(yōu)于純絲素膜。另外，共混膜在乙二醇質(zhì)量分數(shù)為10%時即不溶于水，且柔軟性明顯優(yōu)于純絲素膜，在生物材料上的應(yīng)用更加廣泛。

4 結(jié)論

1)乙二醇/絲素共混膜的絲素溶失率小于2%，具有較高的強度與較好的斷裂伸長率，在干濕態(tài)下的透光率都超過90%，滿足角膜修復(fù)材料的要求。

2)乙二醇/絲素共混膜的主要結(jié)晶結(jié)構(gòu)為SilkI，在tris緩沖溶液中幾乎不降解，在蛋白酶中降解性較好。

3)乙二醇/絲素共混膜，能夠很好地支持成纖維細胞在其上的黏附與增殖，細胞相容性良好。

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