許燕波 錢春香 陸兆文

(東南大學材料科學與工程學院，南京211189)(東南大學江蘇省土木工程材料重點實驗室，南京 211189)

甘油提高巴氏芽孢桿菌脲酶的熱穩(wěn)定性

許燕波 錢春香 陸兆文

(東南大學材料科學與工程學院，南京211189)
(東南大學江蘇省土木工程材料重點實驗室，南京 211189)

摘 要:研究了保存時間和保存溫度對碳酸鹽礦化菌脲酶活性的影響，發(fā)現(xiàn)在低溫4℃條件下，脲酶活性在29 d內出現(xiàn)不同程度下降;常溫短期儲存時，酶活性可以保持3 d，3 d后酶活性值下降明顯.為提高脲酶的熱穩(wěn)定性，向碳酸鹽礦化菌中添加甘油作為保護劑，常溫下添加總體積分數(shù)20%的甘油，可以提高酶的穩(wěn)定性，脲酶活性在30℃下3 d內保持不變，但甘油保護作用有限，高溫儲存超過7 d后酶活性值下降明顯;而在保存溫度4℃條件下，添加體積分數(shù)為10%的甘油，碳酸鹽礦化菌可以儲存30 d，底物分解量可以達到初始菌液的95%.

關鍵詞:碳酸鹽礦化菌;脲酶;甘油;熱穩(wěn)定性

巴氏芽孢桿菌是一株碳酸鹽礦化菌株，在生長過程中產(chǎn)生的脲酶具有分解尿素、產(chǎn)生碳酸根的能力.利用碳酸鹽礦化菌的這種特性，學者們開展了碳酸鹽礦化菌在文物修復、土壤固化、治沙固沙、重金屬污染處理等領域的應用研究，并取得積極的成果［1－5］.

脲酶，系統(tǒng)命名為酰胺水解酶(urea amidohydrolase)，是人類首次獲得晶體并發(fā)現(xiàn)含有鎳離子的金屬酶.酶作為一種具有催化活性的蛋白質，易受到多種因素影響而喪失活性，一般酶要避免處于高溫、強酸、強堿的環(huán)境中，例如，高溫會導致氫鍵或者疏水鍵破壞［6－7］.因此，實現(xiàn)碳酸鹽礦化菌在上述領域的規(guī)模應用，必須考慮脲酶的穩(wěn)定性問題.

添加保護劑是目前工業(yè)上提高酶穩(wěn)定性的最重要手段［6］.劉朝輝等［7］研究了幾種糖類和多元醇類保護劑提高β-甘露聚糖酶熱穩(wěn)定性的作用，研究表明，蔗糖、殼聚糖和山梨醇濃度均為2 g/L時能夠顯著提高該酶的熱穩(wěn)定性.鄭賢良等［8］通過向重組α-環(huán)糊精葡萄糖基轉移酶(α-CGT酶)液中添加化學添加劑來提高其熱穩(wěn)定性及貯存穩(wěn)定性，研究了在不同溫度下添加劑對酶液貯存穩(wěn)定性的影響，當單獨加入各種添加劑在50℃水浴1 h和室溫放置108 d后，發(fā)現(xiàn)含有20%甘油的酶液穩(wěn)定性最好.

本文研究保存時間和保存溫度對碳酸鹽礦化菌脲酶活性的影響，并添加甘油作為保護劑，從而提高脲酶的熱穩(wěn)定性，為礦化菌的應用提供基礎.

1 材料與方法

1.1 材料

試劑藥品為乙二醇、甘油、對二甲氨基苯甲醛、濃鹽酸和乙醇，均為分析純.碳酸鹽礦化菌由本實驗室自己培養(yǎng)制備.

實驗儀器有756紫外可見分光光度計、DDS－12A計電導率測定儀、冷凍恒溫振蕩器(HZ－9210K)、單人單面凈化工作臺(SW-CJ-1FD)和隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱(GNP-9160BS－Ⅲ).

1.2 酶活性測定方法

脲酶的活性以其單位時間內分解尿素的能力來表征.脲酶的活性測試方法有很多，本文選擇電導率法和比色法來測量菌液中的脲酶活性U.

1)電導率法測定脲酶活性

溶液的電導率與溶液中離子的濃度密切相關.隨著微生物分解底物、溶液中銨根離子和碳酸根離子濃度增高，溶液的電導率也隨之增高.

配制2 mol/L的尿素溶液，取25 mL于燒杯中，并加入20 mL去離子水，放入恒溫水浴鍋中，攪拌速度設置為250 r/min.取5 mL完全生長好的菌液，并立即注射到燒杯中，每隔30 s記錄電導率的數(shù)值，直到電導率的數(shù)值變化趨穩(wěn)，電導率的變化值記為k.單位酶活性值記為U，U=2×10kAμmol·urea/min，其中，A為特定系數(shù)，取11.11.

2)比色法

菌株的酶活性是通過測定直接底物的殘留量來確定的.底物濃度的測定方法是利用顯色劑(對二甲氨基苯甲醛)在酸性條件下與底物反應，生成的對二甲氨基甲醛脲為檸檬黃色化合物，其顏色的深淺與底物含量成正比，可以用比色法測定.樣品中的氨和二氧化碳主要改變顯色液的酸度，可以通過加酸中和的方法消除干擾.其反應式為

稱取4 g對二甲氨基苯甲醛，溶于200 mL無水乙醇中，加入20 mL濃鹽酸，混合均勻，儲存于棕色試劑瓶中.

配制標準尿素濃度的溶液，分別移取1，2，4，5 mL尿素溶液于50 mL容量瓶中，加入5 mL對二甲氨基苯甲醛溶液，混合定容.在比色皿中依次得到430 nm波長下的光密度值(OD)，繪制出標準曲線［9］，如圖 1 所示.

圖1 尿素濃度－吸光度標準曲線

1.3 脲酶活性變化

溫度和時間是對微生物生命活動影響較重要的影響因素.而在實際使用過程中又必須考慮短期保存和長期保存2種情況.選擇冰箱的常用冷藏溫度4℃作為長期保存溫度，在短期保存情況下，選擇15，20，25，30和40℃作為短期儲存溫度和酶活性測試溫度，分析脲酶活性隨時間變化.

1.4 保護劑提高脲酶穩(wěn)定性

對加入保護劑的脲酶，在不同溫度下保存后，向每100 mL菌液中加入過量的尿素，通過測定對底物的分解能力，分析脲酶活性在不同溫度下的穩(wěn)定性變化.

2 結果與討論

2.1 保存條件對菌株脲酶活性的影響

4 ℃是常用的冷凍保藏溫度，將100 mL培養(yǎng)好的菌液(去離子水調整OD值為1.2)儲存于4℃冰箱中，利用電導率法測定脲酶活性變化，并選擇15，20，25，30和40℃作為測試溫度點，結果如表1所示.實驗結果發(fā)現(xiàn)，在4℃保存條件下，5 d內電導率顯示的脲酶活性在各個測試溫度點保持不變.而40℃測試溫度點的酶活性值在29 d后從6.66 μmol·urea/min 降到 4.44 μmol·urea/min，下降了33%.15℃測試溫度點的酶活性值15 d內基本不變，在15 d后則由于電導率變化值太小而無法測出，這是因為酶活性值的大小易受溫度影響，在測試溫度較高時酶分解底物的反應速度較快，從而導致顯示的電導率的變化值較大，測試溫度較低時則變化值較小.在20，25，30和40℃測試溫度點，22 d后酶活性值下降均較為明顯.

選擇15，20，25，30和40℃作為常溫下的保存溫度和測試溫度點，分析脲酶活性變化，結果如表1所示.

表1 不同測試溫度的脲酶活性(OD=1.2) μmol·urea/min

當測試溫度為15℃，保存溫度為15，20和25℃時，酶活性值在3 d內可以測出，而在保存溫度為30和40℃條件下，3 d后已經(jīng)無法測出.當測試溫度為25℃時，在保存溫度為15，20和25℃條件下，酶活性值在3 d后下降50%，5 d后從4.44 μmol·urea/min 降到 1 μmol·urea/min 左右，而在30和40℃保存條件下，3 d后下降幅度超過了50%，5 d后酶活性值下降到低于1 μmol·urea/min.因此，常溫下脲酶活性可以保持3 d，在3 d后下降明顯.

2.2 保護劑對脲酶活性影響

碳酸鹽礦化菌不可避免會受到保存溫度和時間的影響，活性降低.乙二醇和甘油作為多元醇，是常見的保護劑.實驗中向每100 mL菌液(OD=1.2)中添加保護劑.保護劑體積分數(shù)和種類分別為0%、20%乙二醇、30%乙二醇、10%乙二醇 +10%甘油、20%甘油和30%甘油.在30℃下保存3 d后，加入過量的尿素，分析菌液對尿素的分解量.實驗結果如圖2所示.

圖2 保護劑對底物分解量的影響

乙二醇的保護作用并不理想，初始100 mL菌液的底物分解量為8.4 g，30℃保存3 d后分解量減少為5.28 g，添加20%乙二醇后100 mL菌液對底物的分解量為5 g.并且乙二醇體積分數(shù)增加并不能提高保護性能，添加30%的乙二醇后底物分解量為2.2 g，但甘油的體積分數(shù)只占10%，底物分解量明顯提高.含有20%甘油作為保護劑的菌液3 d后分解量與初始無異，證明甘油是一種可以用于碳酸鹽礦化菌的良好保護劑.

添加甘油作為保護劑能保持較穩(wěn)定的酶活性，這是因為甘油與水分子相互作用，改變了水的表面張力，使酶與水之間形成溶劑層，同時甘油的羥基與酶的酰胺基以氫鍵的方式相互作用，促進酶的熱穩(wěn)定性.甘油分子較小，可以結合在酶分子的肽鏈空隙里，增強了分子內的疏水作用，減少酶分子間的相互作用;另一方面可阻止部分導致酶失活的物質接近活性中心，從而提高了酶的穩(wěn)定性.

向每100 mL碳酸鹽礦化菌(OD=1.2)中添加甘油作為保護劑，甘油保護劑的體積分數(shù)分別為0%，5%，10%，15%和20%，同時選擇15，30和40℃三個溫度點作為短期保存溫度，菌液在各保存溫度下放置7 d后，取出并向其中加入過量底物，用比色法分析底物的分解量.實驗結果如圖3所示.

圖3 甘油保護不同溫度下放置7 d底物分解圖

在保存溫度15℃儲存7 d后，空白試樣底物分解量為2.90 g，達到初始菌液底物分解量的35%;而添加了甘油作為保護劑的試樣，底物分解量與空白試樣相比都得到提高，且隨著體積分數(shù)增加而增加，甘油保護劑體積分數(shù)為20%時，達到初始菌液底物分解量的73%.

在保存溫度30℃儲存7 d后，空白試樣底物分解量為初始分解量的15%;而添加了甘油作為保護劑的試樣，底物分解量都在50%以上，且隨著甘油保護劑體積分數(shù)的增加，底物分解量也相應增加，但增加幅度不如15℃條件下的增幅明顯.

在保存溫度40℃放置7 d，空白試樣的底物分解量為1.53 g;而添加了甘油作為保護劑的試樣，底物分解量也均未超過50%，甘油保護劑體積分數(shù)為20%，底物分解量也只有3.60 g，說明在儲存溫度較高的情況下甘油保護作用是有限的.

同樣，4℃作為長期保存溫度，向每100 mL菌液中添加甘油作為保護劑，保護劑體積分數(shù)依次為0%，5%，10%，15%和20%.菌液儲存30 d后，取出并向其中加入過量的底物尿素，用比色法分析底物分解量.實驗結果如圖4所示.

圖4 甘油保護下于4℃儲存30 d底物分解圖

在保存溫度4℃條件下保存30 d后，未添加甘油保護劑的空白試樣，底物最大分解量為6.88 g，達到了初始菌液底物分解量的82.5%.添加了甘油作為保護劑的試樣，結果差距不大，甘油保護劑體積分數(shù)10%的試樣，底物最大分解量為7.94 g，達到初始菌液底物分解量的95%.這一方面是由于甘油的保護作用，另一方面微生物在4℃條件下進入休眠狀態(tài)，生命活動停止，酶活性保持穩(wěn)定，溫度提高后加入底物后酶重新開始分解底物.

考慮到實際使用時的需要，常溫下(10～40℃)保存時，選擇體積分數(shù)為20%的甘油作為碳酸鹽礦化菌的保護劑，即向每1 L菌液中添加250 mL甘油，同時保存時間不宜超過7 d.碳酸鹽礦化菌的長期保存可以選擇4℃，甘油保護劑體積分數(shù)為10%.

3 結論

1)碳酸鹽礦化菌的脲酶活性在4℃條件下保存，5 d內電導率顯示的脲酶活性在各個測試溫度點保持不變;在15℃測試溫度點，15 d后酶活性值由于電導率變化太小而無法測出，在20，25，30和40℃測試溫度點，酶活性值22 d后下降均明顯;常溫短期儲存時，酶活性可以保持3 d，在3 d后酶活性值明顯下降.

2)為保持酶活性的穩(wěn)定性，向碳酸鹽礦化菌中添加甘油作為保護劑.研究發(fā)現(xiàn)，常溫下添加總體積分數(shù)20%的甘油，可以提高酶的穩(wěn)定性，但甘油保護作用有限，高溫儲存超過7 d后酶活性值明顯下降;而保存溫度4℃條件下，體積分數(shù)為10%的甘油作為保護劑，碳酸鹽礦化菌可以長期儲存30 d，底物分解量可達到初始菌液的95%.

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Study on enhancing urease thermostability of Bacillus pasteurii by glycerol

Xu Yanbo Qian Chunxiang Lu Zhaowen
(School of Materials Science and Engineering Southeast University，Nanjing 211189，China)(Jiangsu Key Laboratory of Construction Materials，Southeast University，Nanjing 211189，China)

Abstract:Effect of preservation time and temperature on the carbonate-mineralization microbe urease activity is studied.The urease activity decreases in 29 days at 4℃ while it can be kept for 3 days at normal temperature before obvious decrease afterwards.Glycerol is selected as the protective additive to enhance the urease thermostability.The urease activity keep stable for 3 days at 30℃，and the best volume fraction for glycerol is 20%at normal temperature.However its effect of preservation is limited，and the urease activity decreases obviously after 7 days at high store temperature.The decomposition ability can reach up to 95%at 4 ℃ after 30 days with 10%glycerol，and the carbonate-mineralization microbe can be kept in reserve for a month.

Key words:carbonate-mineralization microbe;urease;glycerol;thermostability

中圖分類號:Q89

A

1001－0505(2013)01-0147-05

doi:10.3969/j.issn.1001 －0505.2013.01.028

收稿日期:2012-04-16.

許燕波(1986—)，男，碩士生;錢春香(聯(lián)系人)，女，博士，教授，博士生導師，cxqian@seu.edu.cn.

基金項目:江蘇省科技支撐計劃資助項目(BK2010062).

引文格式:許燕波，錢春香，陸兆文.甘油提高巴氏芽孢桿菌脲酶的熱穩(wěn)定性［J］.東南大學學報:自然科學版，2013，43(1):147－151.［doi:10.3969/j.issn.1001 －0505.2013.01.028］