毛 萍， 莫立乾， 肖小燕， 宋少練， 楊西曉

(南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院藥學(xué)部，廣東廣州510515)

1996 年Witko-Sarsat等［1］首先報(bào)道，晚期氧化蛋白產(chǎn)物 (Advanced oxidation protein products，AOPP)系因患者體內(nèi)過(guò)高的氧化應(yīng)激水平導(dǎo)致各種蛋白質(zhì)氧化損傷所形成的終末產(chǎn)物的總稱。血漿晚期氧化蛋白產(chǎn)物水平增高促使該分子在腎臟和血管等組織中沉積，通過(guò)促發(fā)炎癥正反饋導(dǎo)致單核細(xì)胞持續(xù)活化，從而參與全身性炎癥反應(yīng)的發(fā)生和發(fā)展，與慢性腎病的進(jìn)展及動(dòng)脈粥樣硬化病變的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)?；钚匝?(ROS)是一類具有高度反應(yīng)活性的含氧化合物總稱，當(dāng)ROS產(chǎn)生過(guò)多超出了機(jī)體的清除能力和/或機(jī)體抗氧化能力下降不能及時(shí)清除機(jī)體內(nèi)產(chǎn)生的ROS時(shí)，機(jī)體就會(huì)產(chǎn)生氧化應(yīng)激損傷［2-3］。一氧化氮 (NO)是一種極不穩(wěn)定的生物自由基，當(dāng)其作用于蛋白，脂質(zhì)，核酸等可以引起細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的改變［4］。它介導(dǎo)的生物學(xué)作用包括擴(kuò)張血管、神經(jīng)傳遞，抑制血小板聚集、激活內(nèi)皮細(xì)胞、炎性反應(yīng)、脫噬作用、神經(jīng)傳遞、抗病原體和抗腫瘤［5-7］。Zhou等［8］報(bào)道晚期氧化蛋白產(chǎn)物水平的增高促進(jìn)炎癥反應(yīng);Kishimoto等［9］報(bào)道巨噬細(xì)胞在炎癥反應(yīng)介導(dǎo)的細(xì)胞增殖方面發(fā)揮重要作用，張志輝等［10］發(fā)現(xiàn)晚期氧化蛋白產(chǎn)物可通過(guò)激活單核細(xì)胞釋放ROS，李忠海等［11］發(fā)現(xiàn)晚期氧化蛋白產(chǎn)物能抑制小鼠腹腔巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)型一氧化氮的產(chǎn)生，但晚期氧化蛋白產(chǎn)物對(duì)人巨噬細(xì)胞有何影響還不甚明了。

復(fù)方黃甘顆粒是我院研制出的防治慢性腎衰(CRF)的純中藥制劑中成藥，它的主要成分有大黃、甘草等。本實(shí)驗(yàn)室曾報(bào)道［12］該藥可降低血清肌酐、尿素氮，延緩腎衰進(jìn)展。進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)［13］證實(shí)復(fù)方黃甘提取物可顯著降低慢性腎衰模型動(dòng)物體內(nèi)的晚期氧化蛋白產(chǎn)物水平。因此推測(cè)復(fù)方黃甘提取物對(duì)晚期氧化蛋白產(chǎn)物有一定的清除能力或可逆轉(zhuǎn)晚期氧化蛋白產(chǎn)物對(duì)機(jī)體的不良作用。但對(duì)其發(fā)生作用的途徑和機(jī)理尚不清楚。因此，本實(shí)驗(yàn)旨在研究復(fù)方黃甘提取物對(duì)晚期氧化蛋白產(chǎn)物誘導(dǎo)的人單核細(xì)胞 (THP-1)源性巨噬細(xì)胞產(chǎn)生NO和ROS的影響及可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試劑 THP-1細(xì)胞株購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞生物研究所;無(wú)內(nèi)毒素牛血清白蛋白 (BSA)、四甲基偶氮唑藍(lán) (MTT)、2，7-二氫二氯熒光素二酯 (DCFH-DA)、PMA(佛波醇酯)均購(gòu)自sigma公司;RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清購(gòu)自Gibco公司;復(fù)方藥材均購(gòu)自廣東康美藥業(yè)，均由南方醫(yī)科大學(xué)中藥鑒定教研室張宏偉教授鑒定;Trizol試劑盒和RT-PCR試劑盒購(gòu)自TaKaRa公司，PCR引物合成 (Invitrogen公司)，其余為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器 1285型CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱 (美國(guó)Thermo公司);BX51正置熒光顯微鏡及照相系統(tǒng) (日本Olympus公司);SpectraMax M5多功能酶標(biāo)儀(美國(guó)Molecular Devices公司);RE—52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 (鞏義市予華儀器有限公司);ZK—828型真空干燥箱 (上海實(shí)驗(yàn)儀器總廠);5810R低溫離心機(jī) (德國(guó)Ependorf公司);SB25—12YDTD超聲波清洗器 (寧波新芝生物科技有限公司);ABI 7500熒光定量PCR儀 (美國(guó))。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 復(fù)方黃甘提取物的制備 復(fù)方黃甘顆粒全方藥材加十倍量水，煎煮兩次，每次1.5 h棄渣收集提取液，并將其濃縮至1∶2(mL∶g)，藥液放冷后邊攪拌邊緩慢加入乙醇使其達(dá)80%含醇量，密閉冷藏24 h，濾過(guò)，濾液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除大部分乙醇，再60℃真空干燥得復(fù)方黃甘水提醇沉部分干浸膏，用DMSO溶解配制成母液，待實(shí)驗(yàn)時(shí)用完全培養(yǎng)基配制成相應(yīng)質(zhì)量濃度。

1.3.2 無(wú)內(nèi)毒素晚期氧化蛋白產(chǎn)物的制備與鑒定晚期氧化蛋白產(chǎn)物的制備參考Witko-Sarsat等［14］介紹的經(jīng)典方法:將無(wú)內(nèi)毒素的BSA(20 g/L)與次氯酸鈉40 mmol/L以1/140的等摩爾比例混合均勻，室溫反應(yīng)30 min，制備出晚期氧化蛋白產(chǎn)物，其在無(wú)菌PBS(pH 7.4)中4℃透析24 h，以除去游離的次氯酸鈉，過(guò)濾除菌后4℃保存?zhèn)溆?。按照Witko-Sarsat等［1］的紫外分光光度計(jì)法，于酸性條件下、340 nm測(cè)定晚期氧化蛋白產(chǎn)物制品和對(duì)照BSA樣品中晚期氧化蛋白產(chǎn)物的濃度，以氯胺-T為標(biāo)準(zhǔn)品，實(shí)際測(cè)定的為晚期氧化蛋白產(chǎn)物對(duì)氯胺-T的相對(duì)濃度;Bradford法于595 nm處測(cè)定晚期氧化蛋白產(chǎn)物制品和對(duì)照BSA樣品中總蛋白的量 (g/L);應(yīng)用凝膠法鱟試劑 (靈敏度0.25 EU/mL)定性檢測(cè)晚期氧化蛋白產(chǎn)物制品中內(nèi)毒素的量。

1.3.3 THP-1源性巨噬細(xì)胞的誘導(dǎo)分化和分組用10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)液常規(guī)培養(yǎng)THP-1細(xì)胞，以160 nmol/L的PMA刺激THP-1細(xì)胞24 h［15］后使之分化為巨噬細(xì)胞。以100 mg/L的晚期氧化蛋白產(chǎn)物與人巨噬細(xì)胞共同培養(yǎng)，復(fù)方黃甘提取物不同質(zhì)量濃度干預(yù)處理。

1.3.4 細(xì)胞活性的測(cè)定 用MTT還原法測(cè)定細(xì)胞活性。人巨噬細(xì)胞以5×104個(gè)細(xì)胞/mL密度接種到96孔板內(nèi)，每孔100μL，與晚期氧化蛋白產(chǎn)物共同培養(yǎng)24 h，再加入復(fù)方黃甘提取物繼續(xù)培養(yǎng)24 h，培養(yǎng)結(jié)束后加入MTT 20μL/孔，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后棄上清，加入DMSO溶液150μL/孔，室溫震蕩10 min，于多功能酶標(biāo)儀570 nm處測(cè)定吸光度OD值。

1.3.5 NO的測(cè)定 以100 mg/L的1/140修飾程度的晚期氧化蛋白產(chǎn)物與人巨噬細(xì)胞共同培養(yǎng)于96孔板中24 h，每孔1×106個(gè)細(xì)胞，復(fù)方黃甘提取物不同質(zhì)量濃度 (100、200、400 mg/L)繼續(xù)培養(yǎng)24 h，用Griess試劑法測(cè)定培養(yǎng)上清亞硝酸鹽的量，間接反映NO的產(chǎn)生量即取培養(yǎng)上清液100 μL，加入等量 Griess試劑 (1% 對(duì)氨基苯磺酸，0.1%N-萘基乙二胺，2.5% 磷酸溶液)，室溫反應(yīng)10 min，于550 nm處測(cè)OD，以NaNO2為標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.6 iNOSmRNA表達(dá)水平的測(cè)定 以100 mg/L的1/140修飾程度的晚期氧化蛋白產(chǎn)物與人巨噬細(xì)胞共同培養(yǎng)于6孔板中24 h，復(fù)方黃甘提取物不同質(zhì)量濃度 (400 mg/L)繼續(xù)培養(yǎng)24 h，RT-PCR測(cè)定iNOSmRNA的表達(dá)水平。iNOS引物序列:上游引 物 5'-CCAAGAGAAGAGAGATTCCATTGAA-3'，下游引物5'-TGATTTTCCTGTCTCTGTCGCA-3';βactin引物序列:上游引物5'-CTTCTACAATGAGCTGCGTG-3'，下 游 引 物 5'-CATGAGGTAGTCAGTCAGG-3'。

1.3.7 細(xì)胞內(nèi)活性氧 (ROS)的測(cè)定 以100 mg/L的1/140修飾程度的晚期氧化蛋白產(chǎn)物與人巨噬細(xì)胞共同培養(yǎng)24 h，復(fù)方黃甘提取物不同質(zhì)量濃度(100，200，400 mg/L)繼續(xù)培養(yǎng)24 h，培養(yǎng)結(jié)束后用對(duì)ROS敏感的熒光探針DCFH-DA標(biāo)記細(xì)胞，用多功能酶標(biāo)儀在λex=485 nm、λem=535 nm下測(cè)定細(xì)胞經(jīng)不同刺激后細(xì)胞內(nèi)氧化DCFH產(chǎn)生的熒光量，即細(xì)胞內(nèi)活性氧的產(chǎn)生量。

1.3.8 抑制劑的阻斷實(shí)驗(yàn) 用NF-κB抑制劑吡咯烷二硫代氨基甲酸鹽 (PDTC，10μmol/L)、NADPH氧化酶抑制劑二亞苯基碘 (DPI，100μmol/L)和復(fù)方黃甘提取物 (400 mg/L)分別預(yù)處理細(xì)胞1 h，再用晚期氧化蛋白產(chǎn)物刺激，24 h培養(yǎng)結(jié)束后用熒光探針DCFH-DA標(biāo)記細(xì)胞，測(cè)定細(xì)胞內(nèi)活性氧的產(chǎn)生量;培養(yǎng)上清用ELISA法測(cè)定TNF-α、IL-1β和IL-6的分泌量;RT-PCR測(cè)定TNF-α、IL-1β和IL-6 mRNA的表達(dá)水平。TNF-α基因引物序列 (上游5'-TGGAGAAGGGTGACCGACTC-3'，下 游 5'-TCCTCACAGGGCAATGATCC-3');IL-1β基因引物序列 (上游 5'-CTGTACGATCACTGAACTGC-3'，下游 5-CACCACTTGTTGCTCCATACT-3');IL-6基因引物序列(上游 5'-GGTACATCCTCGACGGCATC-3'，下游 5'-GCCTCTTTGCTGCTTTCACAC-3')。

2 結(jié)果

2.1 晚期氧化蛋白產(chǎn)物制品的測(cè)定 1/140修飾程度的晚期氧化蛋白產(chǎn)物制品及未修飾的BSA中的晚期氧化蛋白產(chǎn)物的量分別為1 047.76μmol/L，20.58μmol/L，其制品與未修飾的BSA的水平比較有顯著性差異 (P＜0.01)，說(shuō)明晚期氧化蛋白產(chǎn)物制備成功;晚期氧化蛋白產(chǎn)物蛋白質(zhì)量濃度為12.04 g/L，而且該制品及未修飾的BSA的細(xì)菌內(nèi)毒素水平均低于0.25 EU/mL。

2.2 THP-1源性巨噬細(xì)胞的誘導(dǎo)分化 THP-1單核細(xì)胞株經(jīng)160 nmol/L PMA刺激誘導(dǎo)分化24 h后，其細(xì)胞形態(tài)由原來(lái)的懸浮生長(zhǎng)，呈球狀，胞漿透澈轉(zhuǎn)變?yōu)門HP-1源性巨噬細(xì)胞，呈貼壁生長(zhǎng)，橢圓狀或梭形，部分伸出偽足，胞漿內(nèi)有顆粒狀物質(zhì)，表明THP-1源性巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)成功。

2.3 細(xì)胞活性的測(cè)定 將復(fù)方黃甘提取物與晚期氧化蛋白產(chǎn)物共培養(yǎng)24 h后用MTT法測(cè)定其細(xì)胞活性，結(jié)果顯示復(fù)方黃甘提取物在10～500 mg/L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)對(duì)人巨噬細(xì)胞的活性無(wú)顯著影響(P＞0.05)，見(jiàn)圖1。

2.4 復(fù)方黃甘提取物與晚期氧化蛋白產(chǎn)物共培養(yǎng)24 h對(duì)人巨噬細(xì)胞產(chǎn)生NO的影響 巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的NO是殺滅病原微生物和腫瘤細(xì)胞的一道初級(jí)防線，可以誘導(dǎo)人巨噬細(xì)胞的凋亡。為了研究復(fù)方黃甘對(duì)晚期氧化蛋白產(chǎn)物誘導(dǎo)人巨噬細(xì)胞產(chǎn)生NO的影響，將復(fù)方黃甘提取物與晚期氧化蛋白產(chǎn)物共培養(yǎng)24 h，測(cè)定其培養(yǎng)上清NO的產(chǎn)生量。圖2顯示晚期氧化蛋白產(chǎn)物抑制人巨噬細(xì)胞產(chǎn)生NO(P＜0.05)，給予復(fù)方黃甘提取物處理后可顯著性誘導(dǎo)NO的產(chǎn)生 (P＜0.01)，且隨質(zhì)量濃度的增加而增加。

圖1 復(fù)方黃甘提取物與晚期氧化蛋白產(chǎn)物共培養(yǎng)24 h對(duì)人巨噬細(xì)胞的活性影響 (n=6，±s)Fig.1 Effect of different concentrations of Compound Huanggan Extract cultured for 24 h by advanced oxidation protein products on the cell viability in macrophages(n=6，±s)

圖2 復(fù)方黃甘提取物與晚期氧化蛋白產(chǎn)物共培養(yǎng)24 h對(duì)人巨噬細(xì)胞產(chǎn)生NO的影響 (n=6，±s)Fig.2 Effect of different concentrations of Compound Huanggan Extract cultured for 24 h by advanced oxidation protein products on the NO level in macrophages(n=6，±s)

2.5 復(fù)方黃甘提取物與晚期氧化蛋白產(chǎn)物共培養(yǎng)24 h對(duì)人巨噬細(xì)胞產(chǎn)生ROS的影響 復(fù)方黃甘提取物與晚期氧化蛋白產(chǎn)物共培養(yǎng)24 h，測(cè)定ROS的產(chǎn)生量。圖3顯示復(fù)方黃甘提取物可顯著性抑制晚期氧化蛋白產(chǎn)物誘導(dǎo)人巨噬細(xì)胞產(chǎn)生ROS(P＜0.01)，其抑制程度呈質(zhì)量濃度依賴性。

圖3 復(fù)方黃甘提取物與晚期氧化蛋白產(chǎn)物共培養(yǎng)24 h對(duì)人巨噬細(xì)胞產(chǎn)生ROS的影響 (n=6，±s)Fig.3 Effect of different concentrations of Compound Huanggan Extract cultured for 24 h by advanced oxidation protein products on the reactive oxygen level in macrophages(n=6，±s)

2.6 抑制劑預(yù)處理人巨噬細(xì)胞對(duì)其活性氧及細(xì)胞因子的影響 用NF-κB抑制劑PDTC、NADPH氧化酶抑制劑DPI和復(fù)方黃甘提取物預(yù)處理細(xì)胞1 h，再用晚期氧化蛋白產(chǎn)物刺激，24 h培養(yǎng)結(jié)束后測(cè)定活性氧量的變化，圖4A顯示兩種抑制劑均能顯著性抑制晚期氧化蛋白產(chǎn)物誘導(dǎo)人巨噬細(xì)胞ROS的產(chǎn)生 (P＜0.01)，復(fù)方黃甘提取物也能顯著性抑制ROS的產(chǎn)生 (P＜0.01)，抑制程度弱于DPI和PDTC抑制劑;圖4B～4D ELISA法顯示3種物質(zhì)均能顯著性抑制TNF-α、IL-1β和IL-6 3種細(xì)胞因子的蛋白表達(dá)，復(fù)方黃甘提取物的抑制程度稍弱。圖5考察了復(fù)方黃甘提取物對(duì)晚期氧化蛋白產(chǎn)物誘導(dǎo)人巨噬細(xì)胞產(chǎn)生ROS的時(shí)間質(zhì)量濃度依賴性。結(jié)果表明當(dāng)用復(fù)方黃甘提取物 (100～400 mg/L范圍)預(yù)處理時(shí)間為0.5 h時(shí)，其抑制ROS的程度在200 mg/L達(dá)到平臺(tái)期;當(dāng)預(yù)處理時(shí)間為1 h時(shí)，其抑制ROS的程度呈現(xiàn)一定的質(zhì)量濃度依賴性。

圖4 DPI、PDTC和復(fù)方黃甘提取物對(duì)晚期氧化蛋白產(chǎn)物誘導(dǎo)人巨噬細(xì)胞ROS(A)(n=6)、TNF-α蛋白 (B)(n=3)、IL-1β蛋白 (C)(n=3)、IL-6蛋白 (D)(n=3)的影響(±s)Fig.4 Effect of DPI，PDTC，Compound Huanggan Extract on advanced oxidation protein products-induced ROS(A)(n=6)and TNF-α (B)(n=3)，IL-1β (C)(n=3)and IL-6(D)(n=3)secretion in THP-1 macrophages(±s)

圖5 復(fù)方黃甘提取物預(yù)處理不同時(shí)間對(duì)晚期氧化蛋白產(chǎn)物誘導(dǎo)人巨噬細(xì)胞 ROS產(chǎn)生的影響 (n=6，±s)Fig.5 Effect of Compound Huanggan Extract by different pre-treatment time on advanced oxidation protein products-induced ROS production in THP-1 macrophages(n=6，±s)

2.7 RT-PCR測(cè)定復(fù)方黃甘提取物對(duì)人巨噬細(xì)胞iNOS、TNF-α、IL-1β和IL-6 mRNA表達(dá)水平的影響 圖6A顯示復(fù)方黃甘提取物可顯著性上調(diào)晚期氧化蛋白產(chǎn)物誘導(dǎo)人巨噬細(xì)胞iNOS mRNA的表達(dá)水平。圖6B～6D表明可顯著性下調(diào)晚期氧化蛋白產(chǎn)物誘導(dǎo)人巨噬細(xì)胞TNF-α、IL-1β和IL-6 mRNA的表達(dá)水平，其結(jié)果與ELISA法測(cè)定的蛋白水平一致。

3 討論

圖6 復(fù)方黃甘提取物對(duì)晚期氧化蛋白產(chǎn)物誘導(dǎo)人巨噬細(xì)胞iNOS m RNA(A)、TNF-αmRNA(B)、IL-1β m RNA(C)、IL-6 mRNA(D)表達(dá)的影響(n=3，±s)Fig.6 Effect of Compound Huanggan Extract on advanced oxidation protein products-induced iNOS mRNA(A)，TNF-α m RNA(B)，IL-1β mRNA(C)and IL-6 mRNA(D)in THP-1 macrophages(n=3，±s)

晚期氧化蛋白產(chǎn)物是一種炎癥介質(zhì)，單核/巨噬細(xì)胞是其選擇性作用的靶細(xì)胞。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)復(fù)方黃甘提取物能夠顯著性增加晚期氧化蛋白產(chǎn)物誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞分泌NO且呈一定的質(zhì)量濃度依賴性，是通過(guò)上調(diào)誘導(dǎo)型一氧化氮合酶的表達(dá)而達(dá)到的。復(fù)方黃甘提取物激活了NO介導(dǎo)的抗增殖效應(yīng)，抑制巨噬細(xì)胞在病灶處的增殖和聚焦，從而減輕病灶局部的微炎癥反應(yīng)。RT-PCR法和ELISA法均表明復(fù)方黃甘提取物可以下調(diào)晚期氧化蛋白產(chǎn)物誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子 TNF-α、IL-1β和IL6，進(jìn)一步減輕了炎癥反應(yīng)。晚期氧化蛋白產(chǎn)物不僅是次氯酸氧化白蛋白的產(chǎn)物，即氧化應(yīng)激介導(dǎo)蛋白損傷的標(biāo)志物，又進(jìn)一步激活巨噬細(xì)胞產(chǎn)生活性氧，形成氧化應(yīng)激的惡性循環(huán)。給予復(fù)方黃甘提取物處理后，其能顯著性抑制晚期氧化蛋白產(chǎn)物誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生ROS的水平，且呈一定的質(zhì)量濃度依賴性，說(shuō)明復(fù)方黃甘提取物能消除已產(chǎn)生的ROS;當(dāng)用復(fù)方黃甘提取物預(yù)處理巨噬細(xì)胞后，ROS的水平也顯著性降低，其降低程度稍弱于NADPH氧化酶抑制劑DPI和NF-κB抑制劑PDTC。由此可以推測(cè)復(fù)方黃甘提取物能夠直接消除ROS，也可能通過(guò)抑制NADPH酶的活性，或者阻斷NF-κB信號(hào)通道來(lái)達(dá)到消除ROS，從而減輕氧化應(yīng)激損傷。進(jìn)一步提出復(fù)方黃甘提取物可能通過(guò)減輕氧化應(yīng)激損傷和改善免疫功能紊亂來(lái)延緩慢性腎衰的進(jìn)程。但復(fù)方黃甘提取物影響ROS產(chǎn)生的機(jī)制還有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)探討。

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