劉 麗，徐明愷，汪思龍，2，張倩茹，王 楠，潘華奇，胡江春，*

(1.中國(guó)科學(xué)院沈陽(yáng)應(yīng)用生態(tài)研究所/森林與土壤生態(tài)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，沈陽(yáng) 110016;2.中國(guó)科學(xué)院會(huì)同森林生態(tài)實(shí)驗(yàn)站，湖南 418307;3.中國(guó)科學(xué)院沈陽(yáng)應(yīng)用生態(tài)研究所，沈陽(yáng) 110016)

杉木Cunninghamia Lanceolata是我國(guó)亞熱帶主要的造林樹(shù)種，在我國(guó)南方林業(yè)生產(chǎn)中占有重要的地位。近幾十年來(lái)，杉木人工林取代自然林并不斷連栽引起的土壤質(zhì)量惡化，生產(chǎn)力下降等問(wèn)題凸顯，嚴(yán)重制約了杉木人工林可持續(xù)發(fā)展［1-3］。針對(duì)杉木純林和連栽帶來(lái)的種種弊端，我國(guó)學(xué)者提出通過(guò)混交和輪栽等經(jīng)營(yíng)模式來(lái)緩解杉木純林和連栽造成的土壤質(zhì)量退化，達(dá)到恢復(fù)土壤肥力，提高杉木人工林可持續(xù)生產(chǎn)力的目的［4］。土壤微生物是土壤生態(tài)系統(tǒng)的重要組分部分，幾乎所有的土壤過(guò)程都直接或間接的與土壤微生物有關(guān)［5］。許多學(xué)者認(rèn)為森林土壤微生物及其生態(tài)功能變化是土壤質(zhì)量演變的關(guān)鍵過(guò)程，并圍繞土壤微生物和功能群開(kāi)展了大量的研究［6-7］。在我國(guó)南方，隨著天然闊葉林被人工林所取代，加上人工林經(jīng)營(yíng)管理措施(混交林模式)的影響，土壤微生物群落結(jié)構(gòu)、種群多樣性及功能群會(huì)隨土壤質(zhì)量發(fā)生改變，進(jìn)而可以反映出一個(gè)生態(tài)系統(tǒng)土壤質(zhì)量受損程度或恢復(fù)潛力。在評(píng)價(jià)人工林經(jīng)營(yíng)管理措施時(shí)，及時(shí)有效的監(jiān)測(cè)土壤微生物及功能群變化，可為實(shí)現(xiàn)退化土壤生態(tài)系統(tǒng)恢復(fù)和人工林可持續(xù)經(jīng)營(yíng)提供理論依據(jù)，對(duì)揭示人工林經(jīng)營(yíng)引起土壤質(zhì)量演變的微生物學(xué)機(jī)理具有重要意義。

當(dāng)前，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，許多方法和理念被應(yīng)用到土壤微生物生態(tài)學(xué)研究中，并因此而逐漸形成了一個(gè)新的研究方向——土壤微生物分子生態(tài)學(xué)［8］，極大的豐富了人們對(duì)土壤生態(tài)系統(tǒng)中不可培養(yǎng)微生物及其群落的認(rèn)識(shí)［9］。我國(guó)有關(guān)土壤微生物與杉木人工林土壤質(zhì)量變化的研究，主要局限于采用傳統(tǒng)方法研究土壤微生物數(shù)量、生化作用等方面［10-11］。然而，不同人工林經(jīng)營(yíng)模式(連栽和混交)引起的杉木人工林土壤質(zhì)量變化對(duì)土壤微生物(細(xì)菌和真菌)的群落結(jié)構(gòu)和多樣性產(chǎn)生怎樣的影響?有哪些關(guān)鍵種群發(fā)生變化?微生物群落結(jié)構(gòu)，多樣性和關(guān)鍵種群變化與杉木人工林土壤退化/恢復(fù)之間有怎樣的關(guān)系?針對(duì)這些問(wèn)題，傳統(tǒng)微生物學(xué)方法已遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能解決。因此，嘗試從分子水平來(lái)解釋這些科學(xué)問(wèn)題是本研究的目的，同時(shí)旨在揭示人工林經(jīng)營(yíng)導(dǎo)致土壤質(zhì)量演變的微生物分子生態(tài)學(xué)機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)域與樣地概況

研究地位于湖南省會(huì)同縣中國(guó)科學(xué)院會(huì)同森林生態(tài)實(shí)驗(yàn)站(109°36'E，26°51'N)，海拔200—500 m，為低山丘陵地貌，屬亞熱帶濕潤(rùn)氣候，年均氣溫16.5℃，年均降雨量約1200 mm，年均相對(duì)濕度80%，土壤為紅黃壤，由板頁(yè)巖發(fā)育而成，土層厚度約50 cm。地帶性植被類(lèi)型為典型的亞熱帶常綠闊葉林，組成樹(shù)種多以栲樹(shù)(Castanopsis spp.)和石櫟(Lithocarpus spp.)為主。但是，由于人為活動(dòng)的影響，原有地帶性森林植被破壞嚴(yán)重，而代之以杉木(C．lanceolata)為主的人工林和馬尾松(Pinus massoniana)為主的或以馬尾松和白櫟(Quercus fabri)、楓香(Liquedabar formosana)等為主的次生常綠針葉、闊葉混交林。

研究樣地分為兩組，一組為杉木連栽林試驗(yàn)地，另外一組為杉木混交林試驗(yàn)地。每一組試驗(yàn)地的坡度、坡向和海拔等立地條件一致。第1組試驗(yàn)地包括:常綠闊葉林(NF，native forest)，平均林齡為41a，到2007年4月為止面積為10 hm2;杉木一代林(FCF，first-generation C．lanceolata plantation)，1983年春在部分NF皆伐地上營(yíng)造;杉木二代林(SCF，second-generation C．lanceolata plantation)，1983年春在21年生杉木一代林皆伐地上營(yíng)造;杉木三代林(TCF，third-generation C．lanceolata plantation)，1983年春在21年生杉木二代林皆伐地上營(yíng)造。3種杉木純林種植密度2000株/hm2，每種林份面積達(dá)到3 hm2。第2組試驗(yàn)地營(yíng)造于1990年，1989年秋杉木一代林皆伐后營(yíng)造的杉木二代林(CF，C．lanceolata plantation)、杉木火力楠混交林(CFM，C．lanceolata-Michelia macclurei mixed plantation)、杉木榿木混交林(CFA，C．lanceolata-Alnus cremastogyne mixed plantation)和杉木刺楸混交林(CFK，C．lanceolata-kalopanax septemlobus mixed plantation)，每種林份面積達(dá)到3 hm2。3種混交林中，杉木與闊葉樹(shù)的比例為8∶2，其中杉木的種植密度約為1296株/hm2，闊葉樹(shù)的種植密度為324株/hm2。CF種植密度為1620株/hm2。

1.2 樣品采集與處理

2007年4月在上述8個(gè)森林類(lèi)型中按照坡面由左至右分別設(shè)置3個(gè)樣方(10 m×10 m)，在每個(gè)樣方內(nèi)設(shè)4個(gè)采樣點(diǎn)，除去表層凋落物后采集0—10 cm土壤，混合，去除植物殘?bào)w和石子，過(guò)2 mm土壤篩，均勻分成3份，一份置于4℃冰箱冷藏，另一份置于-20℃冰箱冷凍，供土壤微生物DGGE分析實(shí)驗(yàn);第3份置室內(nèi)自然風(fēng)干、磨碎、過(guò)100目孔徑篩，用于土壤理化性質(zhì)分析。

1.3 測(cè)定方法

1.3.1 土壤化學(xué)性質(zhì)的測(cè)定

土壤pH測(cè)定，將風(fēng)干供試土樣制成土∶水為1∶2的混合液，靜置30 min，然后用酸度計(jì)測(cè)定。土壤總有機(jī)碳和全氮測(cè)定，將風(fēng)干供試土樣過(guò)100目土壤篩，準(zhǔn)確稱取1.0000 g土樣，土壤總有機(jī)碳和全氮采用元素分析儀vario EL III(Elementar，Germany)直接測(cè)定。土壤可溶性有機(jī)碳測(cè)定采用文獻(xiàn)［12］的方法測(cè)定，供試土壤冷水浸提有機(jī)碳。土壤速效養(yǎng)分測(cè)定，土壤銨態(tài)氮、硝態(tài)氮、速效磷和速效鉀的測(cè)定參照文獻(xiàn)［13］。

1.3.2 土壤微生物總DNA提取與純化

土壤細(xì)菌總DNA提取參照文獻(xiàn)［14］。土壤真菌總DNA提取參照文獻(xiàn)［15］。粗DNA采用DNA膠純化試劑盒Kit Ver.2.0(TaKaRa)進(jìn)行純化，純化方法參照操作說(shuō)明進(jìn)行。

1.3.3 PCR-DGGE

以不同土壤樣品的總DNA為模板，土壤細(xì)菌16SrDNA特異片段用細(xì)菌通用引物GC+341f-907r［16］進(jìn)行PCR擴(kuò)增。土壤真菌28S rDNA特異片段采用通用引物GC+U1-U2［17］進(jìn)行擴(kuò)增。PCR和DGGE條件采用文獻(xiàn)［18］。

1.3.4 特征條帶測(cè)序和系統(tǒng)發(fā)育分析

DGGE特征條帶在無(wú)菌操作下用刀片切下，放入 EP管中，加入30μL TE(10 mmol/L Tris-HCl;1 mmol/LEDTA，pH值8.0)，4℃過(guò)夜處理。待膠中DNA溶出后，取3μL作為模板，再次進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并用DGGE確認(rèn)擴(kuò)增結(jié)果與切膠遷移位置是否一致。確認(rèn)一致后，以不帶GC夾的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物使用試劑盒純化，委托上海生工生物工程技術(shù)有限公司測(cè)序。將所得序列登錄GenBank。應(yīng)用GenBank提供的Blast進(jìn)行同源性比較，并將最鄰近的序列保存為FASTA格式。利用Clustal軟件進(jìn)行多序列比對(duì)并生成ALN格式文件，利用MEGA4.0軟件包中的Seqboot軟件進(jìn)行分析，并應(yīng)用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，確定所測(cè)序列微生物克隆的系統(tǒng)發(fā)育地位。

1.4 計(jì)算和統(tǒng)計(jì)方法

運(yùn)用主成分分析(Principal Component Analysis，PCA)綜合評(píng)價(jià)不同杉木人工林生態(tài)系統(tǒng)土壤肥力質(zhì)量現(xiàn)狀，確定不同杉木人工林土壤質(zhì)量的變化趨勢(shì)。運(yùn)用圖像分析軟件Quantity One(4.6.2)分析DGGE圖譜。利用DGGE圖譜的數(shù)字化結(jié)果計(jì)算土壤樣品微生物群落的Shannon-Wiener指數(shù)(H')、豐富度(S)和均勻度(EH)，以此來(lái)評(píng)價(jià)土壤微生物群落結(jié)構(gòu)多樣性的變化。數(shù)據(jù)的方差分析、標(biāo)準(zhǔn)誤差和相關(guān)性分析均采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行，作圖采用ORIGIN 6.0軟件進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 杉木人工林土壤質(zhì)量變化主成分分析

表1中顯示不同杉木人工林土壤養(yǎng)分、pH值和C/N比的變化。鑒于單一分析各個(gè)指標(biāo)難以明確各杉木人工林土壤質(zhì)量的變化，因此采用PCA方法分析土壤質(zhì)量的變化趨勢(shì)。

表1 不同杉木人工林土壤性質(zhì)變化Table 1 Soil properties of the different plantations

運(yùn)用PCA方法綜合分析土壤養(yǎng)分變化，以各主成分特征貢獻(xiàn)率為權(quán)重，加權(quán)計(jì)算各林地土壤質(zhì)量綜合主成分值(表2)。主成分值是數(shù)值經(jīng)過(guò)標(biāo)準(zhǔn)化后計(jì)算的結(jié)果，正負(fù)不表示實(shí)際意義，只表示相對(duì)大小。土壤質(zhì)量綜合主成分?jǐn)?shù)值顯示，杉木人工林取代自然林導(dǎo)致土壤質(zhì)量明顯降低，并且連栽的造林模式亦導(dǎo)致土壤質(zhì)量下降，土壤質(zhì)量變化趨勢(shì)為:自然林＞杉木一代林＞杉木二代林＞杉木三代林，可見(jiàn)長(zhǎng)期單一種植杉木人工林會(huì)引起土壤質(zhì)量衰退(表2，圖1)。杉木火力楠混交林土壤質(zhì)量綜合主成分值顯著高于杉木純林及其他兩種杉闊混交林，說(shuō)明杉木與火力楠混交后使土壤質(zhì)量明顯改善;杉木與榿木混交后土壤綜合主成分值雖然有所增加，但是卻不顯著，杉木與刺楸混交后土壤綜合主成分值不但沒(méi)有增加，卻顯著下降，可見(jiàn)杉木與榿木、刺楸混交并未達(dá)到改善杉木人工林土壤質(zhì)量的目的(表2，圖1)。

表2 不同杉木人工林土壤質(zhì)量主成分?jǐn)?shù)值Table 2 The values of the principal components associated with PCA of soil fertility in different plantations

通過(guò)主成分分析，將多維的土壤養(yǎng)分變量降維成兩個(gè)變量進(jìn)行分析，即第一主成分(PC1)和第二主成分(PC2)，其中PC1貢獻(xiàn)率達(dá)到54.49%，PC2貢獻(xiàn)率達(dá)到23.22%，二者累計(jì)貢獻(xiàn)率達(dá)到77.71%，因此這兩個(gè)主成分就能夠解釋原始變量。表3中列出初始因子在PC1和PC2上的負(fù)荷矩陣，其中土壤pH值和碳氮比在第二主成分上有較高的負(fù)荷，說(shuō)明PC2主要表示這兩個(gè)初始變量的信息;其它初始因子在第一主成分上有較高負(fù)荷，說(shuō)明第一主成分表示了除土壤pH值和碳氮比以外的土壤性質(zhì)的信息。根據(jù)PC1和PC2的標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)值作圖(圖1)，可以綜合直觀的分析不同杉木人工林土壤質(zhì)量變化趨勢(shì)，避免了采用單純分析某一土壤理化性質(zhì)改變而確定森林土壤質(zhì)量變化趨勢(shì)的弊端。

表3 主成分分析因子負(fù)荷矩陣Table 3 Component matrix of PCA

由圖1可知，NF、FCF、SCF、TCF在PC1和PC2上逐漸分離，并且在PC1上的分離較大，說(shuō)明隨著連栽代數(shù)的增加杉木人工林土壤質(zhì)量與自然林之間的差距拉大;FCF、SCF在圖中未分離，說(shuō)明杉木一、二代林土壤質(zhì)量相似;TCF與FCF、TCF明顯分離，可見(jiàn)連栽杉木人工林在多代連栽的情況下土壤質(zhì)量改變較大，這與綜合主成分值分析的土壤質(zhì)量變化趨勢(shì)結(jié)果相一致。

CFM、CFA、CF和CFK在PC1上逐漸分離，在PC2上分離較小，說(shuō)明這幾種土壤pH值和碳氮比變化較小，而其它養(yǎng)分因子變化較劇烈;CF與CFA在PC1上分離很小，而與其它兩種混交林分離較明顯，這與表2中的綜合主成分值分析相一致，說(shuō)明杉木榿木混交后土壤質(zhì)量變化不明顯?？梢?jiàn)在采用混交模式進(jìn)行林地土壤質(zhì)量恢復(fù)過(guò)程中，杉木與火力楠混交能夠明顯改善土壤質(zhì)量。

2.2 土壤細(xì)菌群落DGGE分析

應(yīng)用本實(shí)驗(yàn)中的總DNA提取方案，得到供試土壤細(xì)菌總DNA片段約20 kb，純化并稀釋后做為模板，采用細(xì)菌通用引物GC+341F-907R［16］對(duì)16SrRNA基因的V3—V8區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到566 bp片段。此處圖省略。

根據(jù)PCR產(chǎn)物在DGGE指紋圖譜上的條帶數(shù)目和遷移的距離，16SrDNA序列的PCR擴(kuò)增與DGGE的結(jié)合運(yùn)用能夠從DNA水平區(qū)別不同微生物群落結(jié)構(gòu)之間的差異。從圖2中可以看出，某些條帶為不同杉木人工林土壤所特有;隨著杉木人工林取代自然林并不斷連載，B5條帶逐漸消失，B6、B7逐漸顯現(xiàn);而B(niǎo)6、B7條帶隨著杉木與闊葉樹(shù)混交又逐漸減弱，而原來(lái)消失的B5條帶逐漸恢復(fù)，伴隨著B(niǎo)1、B3條帶的逐漸增強(qiáng)，這說(shuō)明隨著杉木林生態(tài)系統(tǒng)的變化，土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成產(chǎn)生了相應(yīng)改變。利用DGGE圖譜的數(shù)字化結(jié)果計(jì)算土壤樣品細(xì)菌群落的Shannon-Wiener指數(shù)(H)、豐富度(S)和均勻度(EH)，結(jié)果見(jiàn)圖3。杉木人工林取代自然林后，隨著連栽代數(shù)的增加，土壤細(xì)菌多樣性和豐富度不斷降低(P＜0.05)。杉木與火力楠、榿木混交后細(xì)菌多樣性和豐富度較杉木純林顯著提高(P＜0.05)，而杉木與刺楸混交則造成進(jìn)一步降低(P＜0.05)，說(shuō)明土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)會(huì)隨混交闊葉樹(shù)種的不同而發(fā)生變化。

圖1 不同杉木人工林土壤質(zhì)量主成分分析點(diǎn)圖Fig．1 Principal component(PC1 × PC2)plots generated from covariance matrix of soil physicochemical characteristics of the different plantations NF:常綠闊葉林Native forest;FCF:杉木一代人工林First-generation C．lanceolata plantation;SCF:杉木二代人工林Second-generation C．lanceolata plantation;TCF:杉木三代人工林 Third-generation C．lanceolata plantation;CF:杉木人工林C．lanceolata plantation;CFM:杉木火力楠混交林 C．lanceolata-M．macclurei mixed plantation;CFA:杉木榿木混交林 C．lanceolata-A．cremastogyne mixed plantation;CFK:杉木刺秋混交林 C．lanceolata-K．septemlobus mixed plantation

圖2 土壤細(xì)菌16Sr DNA特異片段PCR-DGGE指紋圖譜Fig．2 DGGE community fingerprints of 16S r DNA fragment from soil bacteria DNA extracted from soil samples under different plantations

圖4 b顯示杉木純林和杉木混交林土壤細(xì)菌群落的變化，CF分別與CFM、CFA在第一主成分PC1(貢獻(xiàn)率為48.52%)、第二主成分PC2(貢獻(xiàn)率為33.70%)上分離，而與CFK在PC1和PC2上分離度都很小，位于同一象限內(nèi)，說(shuō)明杉木純林和杉木刺楸混交林土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)差異較小，與其他兩種混交林差異較大。

如前所述，細(xì)菌DGGE圖譜條帶進(jìn)行主成分分析，PC1主要表示條帶強(qiáng)度大于150的條帶信息，將DGGE圖譜中這些主要特征條帶中的7條切下(B1—B7)，經(jīng)驗(yàn)證后測(cè)序，將所得序列登錄GenBank，獲得登錄號(hào)為GQ423440—GQ423446。經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育分析，結(jié)果顯示湖南會(huì)同地區(qū)杉木人工林土壤中細(xì)菌的優(yōu)勢(shì)種群為αproteobacteria、β-proteobacteria、γ-proteobacteria 和 CFB類(lèi)群(圖5)。

從不同杉木人工林土壤細(xì)菌DGGE圖譜可看出，當(dāng)杉木人工林取代自然林后，土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)受到影響:親緣關(guān)系與 Sphingobacterium sp.、Pedobacter sp.、Burkholderia sp.和Lueifibra arvensicola密切的細(xì)菌種群減少;親緣關(guān)系與Pedobacter cryoconitis密切的細(xì)菌種群受擾動(dòng)較大，在杉木人工林土壤中消失;在杉木一、二和三代林土壤中均出現(xiàn)了親緣關(guān)系與Rhodanobacter sp.密切的細(xì)菌種群;在連栽杉木三代林土壤中細(xì)菌群落改變最大，除與杉木一、二代林變化相同外，還出現(xiàn)了親緣關(guān)系與Xanthomonas sp.密切的細(xì)菌種群(圖2a，圖5)。

杉木與闊葉樹(shù)混交后，土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)也發(fā)生改變:與杉木純林土壤細(xì)菌群落相比，杉木火力楠混交林和杉木榿木混交林土壤細(xì)菌群落多樣性和豐度有所提高，與 Burkholderia sp.、Luteifibra arvensicola、Sphingobacterium sp．和Pedobacter cryoconitis親緣關(guān)系密切的細(xì)菌種群增加;杉木與刺秋混交后，土壤細(xì)菌群落多樣性和豐度沒(méi)有改善，與Sphingobacterium sp.、Pedobacter sp.、Burkholderia sp.和Luteifibra arvensicola親緣關(guān)系密切的細(xì)菌群落消失(圖2b，圖5)。

圖3 不同杉木人工林土壤細(xì)菌群落基因多樣性指數(shù)Fig．3 Genetic diversity indices of microbial communities in different plantations

圖4 不同杉木人工林土壤細(xì)菌DGGE指紋圖譜主成分分析Fig．4 Principal component(PC1×PC2)plots generated from covariance matrix of B－DGGE bands obtained from soil samples under different plantations

圖5 土壤細(xì)菌DGGE指紋圖譜16S r DNA系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig．5 Phylogenetic tree of all sequences of 16S r DNA from B-DGGE bands

圖6 土壤真菌28S r DNA特異片段PCR-DGGE指紋圖譜Fig．6 DGGE community fingerprints of 28S r DNA fragment from soil fungi DNA extracted from soil samples under different plantations

2.3 土壤真菌群落DGGE分析

采用真菌通用引物GC+U1-U2［17］對(duì)28SrRNA基因部分片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到260 bp片段。此處圖省略。

圖6顯示不同杉木人工林土壤真菌特異性PCR-DGGE圖譜，隨著杉木人工林取代自然林并不斷連栽，土壤真菌群落結(jié)構(gòu)的變化較明顯，尤其是NF與TCF土壤真菌DGGE圖譜特征條帶的變化;杉木與闊葉樹(shù)混交后土壤真菌特征條帶也發(fā)生改變，在CFM圖譜中出現(xiàn)條帶F1，在CFA、CFK圖譜中出現(xiàn)了條帶F7，推測(cè)這兩個(gè)條帶所代表的真菌類(lèi)群可能是導(dǎo)致土壤質(zhì)量變化的主要類(lèi)群，還需要進(jìn)一步驗(yàn)證。

圖7結(jié)果顯示，杉木人工林取代自然林后土壤真菌多樣性和豐富度有所提高，但FCF、SCF與NF之間土壤真菌多樣性指數(shù)變化差異沒(méi)有達(dá)到顯著性(P＞0.05)，只有TCF與NF之間達(dá)到顯著性差異(P＜0.05)。隨著杉木不斷連栽土壤真菌多樣性和豐富度呈現(xiàn)提高的趨勢(shì)，杉木二代林與杉木一、三代林之間差異不顯著(P＞0.05)，杉木一代林與杉木三代林之間差異顯著(P＜0.05)，說(shuō)明隨著杉木不斷的連栽土壤真菌群落多樣性和豐度提高的幅度也不斷增加。杉木與3種闊葉樹(shù)混交后土壤真菌多樣性和豐富度較杉木純林顯著降低(P＜0.05)，而3種混交林之間土壤真菌多樣性和豐度變化不大(P＞0.05)?？梢?jiàn)，湖南會(huì)同地區(qū)杉木林土壤真菌多樣性和豐度的變化趨勢(shì)與土壤細(xì)菌是完全不同的。

圖8a顯示連栽杉木人工林土壤真菌群落結(jié)構(gòu)的變化趨勢(shì)，NF與 FCF、SCF主要在 PC2(貢獻(xiàn)率為22.18%)顯著分離，在PC1(貢獻(xiàn)率為61.53%)分離度很小;NF與TCF在PC1和PC2上均明顯分離;FCF和SCF在PC1和PC2上的分離度都很小，而且都與TCF在PC1上明顯分離。由于PC1的貢獻(xiàn)率遠(yuǎn)大于PC2，從不同杉木人工林土壤真菌DGGE圖譜主成分分析可以看出，NF與FCF、SCF土壤真菌群落結(jié)構(gòu)變化差異較小，而其與TCF之間的變化差異較大，說(shuō)明隨著杉木人工林的不斷連栽土壤真菌群落結(jié)構(gòu)變化也加大，這一點(diǎn)與土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的變化趨勢(shì)相似。

圖7 不同杉木人工林土壤真菌群落基因多樣性指數(shù)Fig．7 Genetic diversity indices of microbial communities in different plantations

圖8 不同杉木人工林土壤真菌DGGE指紋圖譜主成分分析Fig．8 Principal component(PC1 × PC2)plots generated from covariance matrix of F-DGGE bands obtained from soil samples under different plantations

圖8b顯示杉木純林和杉木混交林土壤真菌群落的變化，CF分別與CFM、CFA、杉木CFK主要在PC1(貢獻(xiàn)率為58.16%)上分離，說(shuō)明杉木純林與3種杉闊混交林土壤真菌群落結(jié)構(gòu)組成相差很大;3種杉闊混交林主要在PC2(貢獻(xiàn)率為22.63%)上分離，在PC1上分離很小，表明3種杉闊混交林土壤真菌群落結(jié)構(gòu)組成相似。

回家后的賽利亞審視自己未來(lái)的出路：一方面，她繼承了祖母留下的卡拉米洛披肩，看到了自己與他人、家庭、民族之間的聯(lián)系，這使得她理解了祖母和家人、接納了自己的民族身份；另一方面，她以一種更加理智、全面的方式重建自己的文化身份，文化身份不再是一個(gè)非此即彼的選擇，而是一個(gè)融合了多重文化的身份重建。

將土壤真菌DGGE圖譜中主要特征條帶中的10條切下(F1—F10)，條帶強(qiáng)度均大于100，經(jīng)驗(yàn)證后測(cè)序，將所得序列登錄GenBank，獲得登錄號(hào)為GQ423447—GQ423456。經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育分析，結(jié)果顯示湖南會(huì)同地區(qū)杉木人工林土壤中真菌的優(yōu)勢(shì)種群主要是子囊菌和擔(dān)子菌亞門(mén)的種屬(圖9)。

圖9 土壤真菌DGGE指紋圖譜28S r DNA系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig．9 Phylogenetic tree of all sequences of 28Sr DNA from F-DGGE bands

從不同杉木人工林土壤真菌DGGE圖譜中可以看出，當(dāng)杉木人工林取代自然林后，土壤真菌群落結(jié)構(gòu)受到影響:FCF、SCF與 NF之間土壤真菌群落結(jié)構(gòu)變化不大，一部分種群有減少的趨勢(shì)，如親緣關(guān)系與Creosphaeria sassafras、Tubeufia paludosa、Serendipita vermifera密切的真菌種群，一部分種群有增加的趨勢(shì)，如親緣關(guān)系與Pyricularia longispora和Cladosporium cf．subtilissimum密切的微生物種群，但也有一些種群消失，如親緣關(guān)系與Pseudomassaria carolinesis和Sphaerobolus iowensis密切的微生物種群;土壤真菌群落結(jié)構(gòu)在TCF與NF 之間變化較大，親緣關(guān)系與 Pseudomassaria carolinesis、Creosphaeria sassafras、Sphaerobolus iowensis、Pyricularia longispora和Cladosporium cf．subtilissimum密切的真菌種群消失，而親緣關(guān)系與Sclerotinia sp.、Mycosphaerella sp.和Marasmius graminum密切的真菌種群出現(xiàn)(圖6a，圖9)，可見(jiàn)連續(xù)單一種植杉木人工林會(huì)引起土壤真菌群落劇烈改變。

杉木與闊葉樹(shù)混交后，土壤真菌群落結(jié)構(gòu)也發(fā)生改變:主要表現(xiàn)為某些種群的恢復(fù)，如與Creosphaeria sassafras和Sphaerobolus iowensis親緣關(guān)系密切的真菌種群出現(xiàn)，與Mycosphaerella sp.和Marasmius graminum親緣關(guān)系密切的真菌種群消失;大部分共有條帶亮度接近于自然林圖譜，說(shuō)明真菌群落結(jié)構(gòu)組成在杉闊混交林土壤中有逐漸接近自然林的趨勢(shì)(圖6b，圖9)。

2.4 杉木人工林土壤微生物群落結(jié)構(gòu)變化與土壤質(zhì)量的關(guān)系

表4結(jié)果顯示，土壤細(xì)菌多樣性指數(shù)變化與大部分土壤化學(xué)性質(zhì)顯著相關(guān)，其中與全氮、可溶性碳、銨態(tài)氮、速效鉀和有效磷呈極顯著正相關(guān)(P＜0.01)，與土壤pH值和總有機(jī)碳呈顯著正相關(guān)(P＜0.05)，與土壤質(zhì)量主成分值極顯著正相關(guān)(P＜0.01)。土壤細(xì)菌主成分分析PC1也與土壤質(zhì)量和大部分土壤化學(xué)性質(zhì)顯著正相關(guān)。

表4 杉木人工林土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)變化與土壤化學(xué)性質(zhì)的相關(guān)性分析Table 4 Pearson's correlation analyses between the bacterial community and soil properties from all sites

表5結(jié)果顯示，土壤真菌多樣性指數(shù)變化與大部分土壤化學(xué)性質(zhì)均無(wú)顯著相關(guān)性(P＞0.05)，僅僅與土壤碳氮比呈顯著正相關(guān)，與土壤pH呈顯著負(fù)相關(guān)(P＜0.05)，這一點(diǎn)與細(xì)菌結(jié)果明顯不同。表示自然林和杉闊混交林的DGGE特征條帶以及幾種土壤中共有條帶的PC1也與大部分土壤性質(zhì)無(wú)顯著相關(guān)性(P＞0.05);然而，表示杉木三代林的DGGE特征條帶的PC2與多數(shù)土壤性質(zhì)顯著負(fù)相關(guān)(P＜0.05)，包括總有機(jī)碳、總有機(jī)氮、可溶性碳、銨態(tài)氮、速效磷以及土壤質(zhì)量主成分值(PC1和PC)，可見(jiàn)PC2表示的條帶所代表的真菌種群可能是導(dǎo)致土壤質(zhì)量變化的關(guān)鍵種群。

表5 杉木人工林土壤真菌群落結(jié)構(gòu)變化與土壤化學(xué)性質(zhì)的相關(guān)性分析Table 5 Pearson's correlation analyses between the fungal community and soil properties from all sites

3 討論

3.1 杉木人工林土壤質(zhì)量變化過(guò)程中土壤細(xì)菌群落變化特征

基于細(xì)菌16SrDNA保守特點(diǎn)，DGGE指紋圖譜技術(shù)目前已經(jīng)廣泛的用于監(jiān)測(cè)細(xì)菌生長(zhǎng)和分析細(xì)菌群落，本文運(yùn)用該技術(shù)結(jié)合PCA分析，區(qū)別不同杉木林土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的變化，并采用多樣性指數(shù)(H，S和EH)評(píng)價(jià)不同土壤微生物群落多樣性，高的多樣性指數(shù)數(shù)值表明高的微生物群落多樣性［19］。本研究表明，連栽杉木人工林土壤細(xì)菌群落多樣性和豐度顯著低于自然林和杉闊混交林(除杉木刺楸混交林外)，并且隨著連栽代數(shù)的增加不斷降低。這與以前采用平板分離計(jì)數(shù)法的分析結(jié)果相一致。張其水等報(bào)道，杉木一代林土壤細(xì)菌數(shù)量高于二代、三代林，而且各類(lèi)型細(xì)菌組成都隨著杉木連栽代數(shù)的增加而發(fā)生明顯變化［20］。陳楚瑩等報(bào)道，杉木純林土壤細(xì)菌數(shù)量?jī)H為杉木火力楠混交林的60%左右，并認(rèn)為土壤微生物數(shù)量與林分中闊葉樹(shù)比例呈正相關(guān)［5］。

土壤微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性會(huì)受多種因素的影響，一些為外因，如植被類(lèi)型、氣候條件、土壤類(lèi)型和人類(lèi)活動(dòng)等，另外一些為內(nèi)因，主要為與土壤微生物生長(zhǎng)密切相關(guān)的土壤有機(jī)質(zhì)組成和土壤養(yǎng)分等。森林土壤有機(jī)質(zhì)主要來(lái)源于植被凋落枝葉、地下凋落物、根系分泌物和土壤生物殘?bào)w等的分解與周轉(zhuǎn)。土地利用方式和管理措施能夠影響土壤有機(jī)質(zhì)的數(shù)量和質(zhì)量，杉木人工林取代天然次生闊葉林后，導(dǎo)致土壤生態(tài)系統(tǒng)中凋落物數(shù)量減少，種類(lèi)單一化，進(jìn)而使土壤有機(jī)質(zhì)的含量明顯減少，質(zhì)量明顯下降［21］。本文研究結(jié)果表明杉木純林土壤有機(jī)質(zhì)含量顯著低于自然林和杉闊混交林，通過(guò)相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，土壤有機(jī)質(zhì)的變化與土壤中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)及多樣性改變具有顯著正相關(guān)。這一結(jié)果表明，森林土壤有機(jī)物質(zhì)的質(zhì)和量影響生態(tài)系統(tǒng)分解者的生長(zhǎng)代謝，進(jìn)而影響土壤中有機(jī)質(zhì)的歸還和養(yǎng)分周轉(zhuǎn)。

本研究發(fā)現(xiàn)，土壤細(xì)菌多樣性指數(shù)和土壤中總有機(jī)氮和速效氮含量顯著正相關(guān)，這可能與土壤中參與氮素周轉(zhuǎn)的微生物功能群有關(guān)。土壤中氮素含量是生物生長(zhǎng)的限制因子，許多研究表明，土壤中氮素含量變化會(huì)引起土壤微生物生物量、活性和群落組成的變化［22］。Singh報(bào)道土壤微生物直接調(diào)節(jié)土壤氮素的供給，土壤中氨化細(xì)菌和硝化細(xì)菌的數(shù)量及其氨化作用和硝化作用的強(qiáng)弱直接與土壤活性氮素含量相關(guān)［23］。因此，在本文基礎(chǔ)上還應(yīng)該對(duì)土壤中參與氮循環(huán)的微生物功能群進(jìn)行研究，探究其與土壤養(yǎng)分變化之間的相互作用。

土壤細(xì)菌群落組成變化是影響土壤質(zhì)量和植物生長(zhǎng)的重要因素。本研究結(jié)果顯示，Burkholderia sp.、Sphingobacterium sp.、Xanthomonas sp.和Pedobacter sp.親緣關(guān)系密切的細(xì)菌種群在不同杉木人工林土壤中有明顯的變化。伯克霍爾德氏菌(Burkholderia sp.)的某些菌株能夠產(chǎn)生抗真菌的物質(zhì)，用于防治多種病原真菌引起的農(nóng)作物以及森林苗木的根腐、莖腐、猝倒和紋枯等病害［24-25］。此外，有報(bào)道表明伯克霍爾德氏菌屬的某些菌株具有解磷作用，可提高土壤有效磷含量［26］。土地桿菌屬(Pedobacter sp.)的某些菌株能夠產(chǎn)生植酸酶，可分解植物種子中的植酸磷，釋放出肌醇和無(wú)機(jī)磷，使土壤中有效磷素增加［27］。本研究發(fā)現(xiàn)，DGGE主成分分析PC1與土壤有效磷呈顯著正相關(guān)，可能是由于PC1代表的土地桿菌屬和伯克霍爾德氏菌等解磷細(xì)菌數(shù)量和組成的改變引起土壤磷素的變化，進(jìn)而影響其它種屬土壤微生物(如參與凋落物分解和氮素循環(huán)的微生物)和杉木的生長(zhǎng)。另一方面，在南方酸性紅壤地區(qū)土壤全磷含量比較低，這也在一定程度上限制了土壤解磷細(xì)菌的生長(zhǎng)，導(dǎo)致土壤有效磷含量降低，使土壤微生物(如參與凋落物分解和氮素循環(huán)的微生物)和植物生長(zhǎng)受到限制。黃單胞菌屬(Xanthomonas sp.)是一類(lèi)植物致病菌，能夠引起植物葉片枯萎，甚至造成系統(tǒng)性侵染，致使植株死亡，尤其在雨季傳播力很強(qiáng)［28］。本文研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在自然林及杉木一、二代林土壤中與黃單胞菌屬親緣關(guān)系密切的條帶所代表的種群沒(méi)有出現(xiàn)，在杉闊混交林土壤中該菌屬細(xì)菌不占有優(yōu)勢(shì)地位，而在杉木三代林及杉木純林土壤中黃單胞菌屬成為優(yōu)勢(shì)種群之一，湖南會(huì)同地區(qū)屬于亞熱帶濕潤(rùn)氣候，雨季較長(zhǎng)，這種特殊的氣候條件能夠加速黃單胞菌屬的生長(zhǎng)和傳播，因此推測(cè)連栽杉木人工林出現(xiàn)的枝條枯萎、生長(zhǎng)緩慢和生產(chǎn)力下降可能與土壤中植物病害菌占優(yōu)勢(shì)地位有關(guān)，對(duì)于是何種原因誘導(dǎo)了連栽杉木林土壤中黃單胞菌屬大量繁殖，還有待進(jìn)一步研究。

3.2 杉木人工林土壤質(zhì)量變化過(guò)程中土壤真菌群落變化特征

本文根據(jù)真菌28SrDNA目的片段的DGGE指紋圖譜，運(yùn)用PCA分析不同杉木林土壤真菌群落結(jié)構(gòu)的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其變化趨勢(shì)與細(xì)菌相反，自然林和杉闊混交林土壤真菌多樣性指數(shù)低于連栽杉木人工林。李延茂等采用可培養(yǎng)技術(shù)發(fā)現(xiàn)在杉木林隨著連栽代數(shù)的增加土壤細(xì)菌數(shù)量下降而土壤真菌數(shù)量顯著增加［11］，然而并沒(méi)有對(duì)這一現(xiàn)象進(jìn)行解釋。本文通過(guò)相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，土壤pH值分別與土壤細(xì)菌、真菌群落結(jié)構(gòu)及多樣性指數(shù)變化呈顯著正相關(guān)和負(fù)相關(guān)。土壤pH值一直被認(rèn)為是影響土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的重要因素，土壤細(xì)菌和真菌分別在偏堿性和偏酸性土壤中占據(jù)優(yōu)勢(shì)地位［29］。土壤pH值能夠通過(guò)影響土壤基質(zhì)的組成、化學(xué)性質(zhì)和利用效率而使土壤微生物群落組成和多樣性受到干擾。本文研究顯示，自然林和杉闊混交林土壤pH值高于連栽杉木人工林，不斷連續(xù)栽種杉木純林會(huì)導(dǎo)致土壤酸化。與闊葉樹(shù)相比，針葉樹(shù)凋落物富含較多的蠟質(zhì)、樹(shù)脂和木質(zhì)素等分解產(chǎn)酸性物質(zhì)，單一針葉樹(shù)種的大面積種植可由于其凋落物質(zhì)和量引起土壤酸化，這在我國(guó)南方普遍存在。然而當(dāng)闊葉樹(shù)種引入杉木人工林種植管理中，可以扭轉(zhuǎn)該現(xiàn)象的發(fā)生?？梢?jiàn)，造林管理措施能夠通過(guò)影響凋落物的組成而引起土壤pH變化，進(jìn)而改變土壤微生物群落結(jié)構(gòu)組成。

土壤碳氮比是影響土壤微生物群落結(jié)構(gòu)變化的又一重要因子。本研究結(jié)果表明土壤真菌群落結(jié)構(gòu)及多樣性指數(shù)變化與土壤C/N呈顯著正相關(guān)。采用相同的方法，Yao等研究表明土壤真菌多樣性隨著土壤C/N增加而變化，并認(rèn)為高C/N的土壤基質(zhì)可能富含木質(zhì)素和多酚類(lèi)物質(zhì)，這些物質(zhì)能夠誘導(dǎo)某些真菌生長(zhǎng)［30］。此外，采用PFLA方法，Hackl等評(píng)價(jià)12種森林土壤中真菌多樣性和豐度的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)針葉樹(shù)種森林土壤有機(jī)質(zhì)具有高的碳氮比，同樣也具有更為豐富的真菌類(lèi)群，他們推測(cè)某些真菌類(lèi)群適應(yīng)針葉樹(shù)森林土壤的高C/N，通過(guò)其菌絲轉(zhuǎn)化更多的土壤有機(jī)碳［31］。

本研究發(fā)現(xiàn)杉木一、二代林與自然林土壤真菌群落結(jié)構(gòu)組成變化不大，但是杉木三代林土壤真菌群落結(jié)構(gòu)變化劇烈，出現(xiàn)了一些特征菌屬，其中包括核盤(pán)菌屬、球殼菌屬和小皮傘菌屬等，這些菌屬的出現(xiàn)可能與該林分土壤質(zhì)量和生產(chǎn)力下降有關(guān)。核盤(pán)菌(Sclerotinia sclerotiorum)是一種植物病原菌，由其引起的菌核病是世界性分布的重要病害。自從20世紀(jì)70年代，國(guó)外就開(kāi)始報(bào)道了該菌屬是花旗松(Douglas fir)、冷杉和銀杉(Abies amabilis)等經(jīng)濟(jì)林木重要致病真菌［32］。球殼菌屬(Mycosphaerella sp.)也包含了許多危害嚴(yán)重的植物病原菌，如美洲的松針紅斑病菌(Mycosphaerella pini)能夠引起針葉樹(shù)病害［33］，Mycosphaerella aleuritidis是我國(guó)云南油桐黑斑病的致病菌［34］。據(jù)報(bào)道小皮傘菌屬(Marasmius sp.)主要生長(zhǎng)在腐爛的枯枝落葉上，是一類(lèi)凋落物分解菌屬，曾經(jīng)發(fā)現(xiàn)其為我國(guó)小興安嶺楓樺紅松林凋落物分解菌之一［35］。本文研究發(fā)現(xiàn)，小皮傘菌屬是杉木三代林土壤真菌的優(yōu)勢(shì)種群，這可能與杉木純林凋落物極難分解，誘導(dǎo)一些木腐真菌的生長(zhǎng)有關(guān)，但對(duì)這一推測(cè)還需進(jìn)一步研究證實(shí)。通過(guò)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，本文發(fā)現(xiàn)親緣關(guān)系與這些菌屬相關(guān)的條帶在真菌DGGE主成分分析PC2的載荷較大，PC2與土壤質(zhì)量顯著負(fù)相關(guān)，推測(cè)杉木人工林土壤質(zhì)量衰退，生產(chǎn)力下降可能與植物致病真菌占優(yōu)勢(shì)地位有關(guān)。

土壤真菌DGGE主成分分析PC1代表自然林和杉闊混交林主要種群信息，其種群數(shù)量和組成在杉木人工林取代自然林以及杉木和闊葉樹(shù)混交這些造林活動(dòng)過(guò)程中均發(fā)生了改變，Sphaerobolus sp.是與土壤有機(jī)質(zhì)的分解有關(guān)［36］，Creosphaeria sp.某些菌株能夠產(chǎn)生抗菌物質(zhì)［37］，而有些種屬Tubeufia sp.和Serendipita sp.尚未有具體生態(tài)功能的報(bào)道。它們的變化與本文所研究的多數(shù)土壤養(yǎng)分變化并不直接相關(guān)，但是這些類(lèi)群優(yōu)勢(shì)地位的喪失和恢復(fù)對(duì)于維持土壤真菌群落的穩(wěn)定具有重要的意義，杉木三代林土壤中這些種屬真菌受到擾動(dòng)劇烈，一些種群消失，取而代之的植物致病菌占據(jù)優(yōu)勢(shì)地位，土壤原有真菌群落結(jié)構(gòu)平衡被破環(huán)，同時(shí)土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)也被破壞，嚴(yán)重影響土壤物質(zhì)周轉(zhuǎn)和養(yǎng)分循環(huán)，表4中真菌DGGE主成分分析PC2與土壤總有機(jī)碳氮、可溶性碳、銨態(tài)氮和有效磷變化顯著負(fù)相關(guān)，證實(shí)了上述論述。

目前，對(duì)于上述微生物種屬在杉木人工林土壤中尚未見(jiàn)報(bào)道，本文通過(guò)不依賴于培養(yǎng)的分子生物學(xué)技術(shù)，發(fā)現(xiàn)湖南會(huì)同地區(qū)供試杉木人工林土壤細(xì)菌和真菌優(yōu)勢(shì)種群，尤其是與土壤養(yǎng)分循環(huán)和植物病害有關(guān)的微生物種群發(fā)生變化，并詳細(xì)分析了土壤細(xì)菌種群變化與土壤化學(xué)性質(zhì)變化的關(guān)系。后續(xù)研究將對(duì)重要的土壤微生物功能群進(jìn)一步探討，如參與氮素循環(huán)的微生物功能群變化及其與土壤氮素周轉(zhuǎn)之間的關(guān)系;參與凋落物分解的微生物功能群種群組成的變化及其與有機(jī)質(zhì)歸還之間的關(guān)系;拮抗致害真菌的微生物功能群的變化及其與土壤自凈功能之間的關(guān)系等諸多問(wèn)題。對(duì)這些科學(xué)問(wèn)題的解答能夠進(jìn)一步解釋杉木人工林經(jīng)營(yíng)引起土壤質(zhì)量變化的微生物機(jī)理，并為制定合理造林管理措施提供理論依據(jù)。

致謝:感謝中國(guó)科學(xué)院會(huì)同森林生態(tài)實(shí)驗(yàn)站陳楚瑩、馮宗煒、廖利平和汪思龍營(yíng)造的杉木實(shí)驗(yàn)林，本實(shí)驗(yàn)是在他們研究樣地的基礎(chǔ)上進(jìn)行的。

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