王佳雯 陸金根 曹永清 潘一濱

(上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院肛腸科，上海，200032)

升丹是目前臨床應(yīng)用的主要提膿祛腐藥物。但近年臨床和動物實驗均表明潰瘍創(chuàng)面應(yīng)用升丹都會有不同程度的汞吸收，其毒性有蓄積性，可對內(nèi)臟等造成損害，甚至可以引起中毒致死。其他類提膿祛腐藥物大多數(shù)也是有毒性的藥物。因此，尋求高效、無毒的升丹替代品無疑成為中醫(yī)外科工作者迫在眉睫的任務(wù)［1－3］。上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院陸金根教授通過對古代醫(yī)籍和現(xiàn)代文獻(xiàn)的回顧性理論研究［4－19］，并結(jié)合中醫(yī)外科多年的臨床用藥經(jīng)驗，擬方姜露散。本研究通過動物實驗，觀察該方對感染性創(chuàng)面提膿祛腐的作用，并探討其作用的可能機(jī)制及用藥安全性，為中藥提膿祛腐藥物提供高效、無毒的升丹替代品。

1 材料與方法

1.1 動物 健康SD大鼠72只，SPF級，體質(zhì)量200～220 g/只，由上海斯萊克實驗動物有限公司提供，飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院科研中心。

1.2 藥物 姜露散由上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院制劑室制備。九一丹由上海華鷹藥業(yè)有限公司提供。

1.3 細(xì)菌 采用上海市臨床檢驗中心提供的大腸埃希菌標(biāo)準(zhǔn)菌株(ATCC 25922)，配制成濃度為5億菌株/mL的大腸埃希菌混懸液。

1.4 主要試劑與儀器 溶酶體抗體(美國Santa Cru)、EnVision 試劑即用型(丹麥 Dako)、3＇3 － 二氨基聯(lián)苯胺鹽酸鹽(DAB)顯色液試劑盒(武漢博士德)、大鼠IL－1β定量ELISA試劑盒(美國RD);生物顯微鏡(Olympus BH2)、數(shù)碼相機(jī)(Nikon E4500)、紫光分光光度計(日本Beckman Du－600)、全自動生化檢測分析儀(OLYMPUS AU460)。

1.5 方法

1.5.1 分組、造模與給藥 參照上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院張雅明［20］以及南京市中醫(yī)院鄭雪平［21］等造模方法，并改良付小兵［22－23］全層皮膚缺損法建立大鼠感染性創(chuàng)面模型。在麻醉后的大鼠頸背部作一直徑2 cm的圓形切口，深達(dá)肌筋膜，破壞部分肌肉表面筋膜，止血后在創(chuàng)面上覆蓋大小相仿的紗布，紗布中浸入新培養(yǎng)的大腸埃希菌標(biāo)準(zhǔn)菌株1 mL(約5億菌株)。3 d后，創(chuàng)口表面附有膿性分泌物，周圍皮溫略升高，感染性創(chuàng)面模型造模成功。將大鼠隨機(jī)分為三組:姜露散組、九一丹組、模型組，每組24只。造模各組大鼠每天分別給予姜露散、九一丹創(chuàng)面換藥，模型組給予生理鹽水創(chuàng)面換藥，1次/d，連續(xù)治療14 d。

1.5.2 觀察大鼠一般情況 包括精神狀態(tài)、活動情況、進(jìn)食量、大小便情況。

1.5.3 創(chuàng)面膿腐脫落時間 從用藥開始到膿腐脫落的時間(通過創(chuàng)面色澤的變化判斷，即當(dāng)創(chuàng)面變?yōu)轷r紅色，見到肉芽組織為止)。

1.5.4 創(chuàng)面分泌物量 第3、7、14 d，無明顯分泌物，計0分;分泌物量少，用一根消毒棉簽可以吸凈，計1分;分泌物量較多，用二根消毒棉簽可以吸凈，計2分;分泌物量大，用二根以上消毒棉簽可以吸凈，計3分。

1.5.5 免疫組化EnVision法檢測創(chuàng)面肉芽組織中溶菌酶含量 第3、7、14 d，各組隨機(jī)處死8只大鼠，取近創(chuàng)緣約0.5 cm×0.5 cm的肉芽組織，按免疫組化試劑盒操作說明進(jìn)行。對每張免疫組化片高倍鏡下(×250)隨機(jī)取3個視野窗，在OLYMPUS 1X70倒置熒光圖像采集分析系統(tǒng)上利用Imge－Pro Plus分析軟件，將陽性細(xì)胞用像素點表示并換算成μm2，采用Imagepro－plus圖像分析系統(tǒng)分析軟件，以陽性反映細(xì)胞總面積代表陽性反應(yīng)細(xì)胞數(shù)，結(jié)果取均值。

1.5.6 雙抗體夾心ABC－ELISA法檢測創(chuàng)面肉芽組織中IL－1β含量 第3、7、14 d，各組隨機(jī)處死8只大鼠，取近創(chuàng)緣約100 mg的肉芽組織，按大鼠IL－1β定量ELISA試劑盒操作說明進(jìn)行。以標(biāo)準(zhǔn)品不同稀釋濃度為橫坐標(biāo)，光學(xué)密度值(optical density，OD)為縱坐標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，根據(jù)樣品OD值查出相應(yīng)IL－1β含量。

1.5.7 酶法檢測主要肝腎功能指標(biāo) 第7、14 d，各組隨機(jī)處死8只大鼠，腹主動脈采血。將取得的血清置于全自動生化檢測分析儀中，直接讀取血清BUN，CREA，ALT值。

1.5.8 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 12.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及分析，實驗數(shù)據(jù)以(s)表示，方差齊者用LSD法，方差不齊者用Dunnett＇s T3法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況 造模成功后各組動物都呈病態(tài)，皮毛雜亂，倦縮少動，攝食量、攝水量明顯減少。

表1 各組創(chuàng)面膿腐脫落時間比較(d，s)

表1 各組創(chuàng)面膿腐脫落時間比較(d，s)

注:與模型組比較，＊＊P＜0.01;與九一丹組比較，*P＞0.05。

*姜露散 16 6.67±0.651 16 9.67±0.888九一丹 16 7.08±0.900＊＊模型

表2 第3 d、7 d、14 d、各組創(chuàng)面分泌物量計分比較(s)

表2 第3 d、7 d、14 d、各組創(chuàng)面分泌物量計分比較(s)

注:與模型組比較，＊＊P＜0.01;與九一丹組比較，*P＞0.05。

7 d組別 3 d 14 d只數(shù) 計分姜露散 24 2.39±0.502＊＊ 16 1.67±0.651* 8 0.67±0.516只數(shù) 計分 只數(shù) 計分*九一丹 24 2.33±0.485＊＊ 16 1.33±0.492* 8 0.50±0.548*模型 24 1.78±0.428 16 1.25±0.452* 8 0.33±0.516*

表3 各組創(chuàng)面肉芽組織中溶菌酶含量比較(μm2，s)

表3 各組創(chuàng)面肉芽組織中溶菌酶含量比較(μm2，s)

注:與模型組比較，＊＊P＜0.01。

姜露散 8 1283.3550±66.39142＊＊1266.5400±70.97180＊＊597.9617±71.72339九一丹 8 1276.5467±73.77489＊＊1258.2908±75.02942＊＊ 559.6925±55.83410模型 8 691.9958±206.29910 749.2492±65.48238 602.9333±78.02048

表4 各組創(chuàng)面肉芽組織中IL－1β含量比較(pg/mL，s)

表4 各組創(chuàng)面肉芽組織中IL－1β含量比較(pg/mL，s)

注:與模型組比較，＊＊P＜0.01。

3 d 7 d 14 d姜露散 8 51.6633±9.44752＊＊ 27.9583±7.54641＊＊組別 只數(shù)13.6467±2.93296九一丹 8 50.6633±8.64725＊＊ 27.0633±7.56325＊＊ 12.4250±2.38189模型 8 14.1333±3.7858 11.6967±2.25507 11.2200±2.28874

2.2 各組創(chuàng)面膿腐脫落時間比較 見表1。

2.3 各組創(chuàng)面分泌物量比較 見表2。

2.4 各組創(chuàng)面肉芽組織中溶菌酶含量比較 見表3。

2.5 各組創(chuàng)面肉芽組織中IL－1β含量比較 見表4。

2.6 各組血清BUN、CREA、ALT含量比較 見表5。

表5 各組血清BUN、CREA、ALT含量比較(s)

表5 各組血清BUN、CREA、ALT含量比較(s)

注:與模型組比較，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01;與九一丹組比較，△P ＜0.05，△△P ＜0.01。

CREA(mmo1/L)組別 只數(shù) BUN(mmo1/L)ALT(U/L)7 d 14 d姜露散 8 7.2283±0.24302△ 8.0167±0.76995△ 35.1033±3.13722△ 33.8683±3.79128△ 38.7000±4.93994△ 38.6400±4.36148 7 d 14 d 7 d 14 d△△九一丹 8 9.1700±1.14745* 10.5850±1.80280*47.2250±2.43482*49.4300±2.27716*43.6317±2.48398*52.9633±9.04799＊＊模型 8 6.6583±0.29546 7.0533±0.33285 32.8667±2.40935 32.6983±2.32029 37.3183±2.90987 39.7467±2.32760

3 討論

3.1 中醫(yī)對“提膿祛腐法”的認(rèn)識 “提膿祛腐法”是中醫(yī)外科治療急慢性感染性創(chuàng)面的治療大法之一，其包含“提膿”和“祛腐”兩個方面的內(nèi)容?！疤崮摗睘榛赡?，只有將腐肉轉(zhuǎn)化成膿汁，才能利于創(chuàng)面的引流;同時，“膿”本身又能促進(jìn)創(chuàng)面的愈合及加強創(chuàng)面的炎性反應(yīng)?！办罡奔赐ㄟ^藥物或手術(shù)的作用，將創(chuàng)面上的壞死組織、過度增生的病理性肉芽組織以及其他影響創(chuàng)口順利愈合的各種病理組織(如囊壁、瘺管壁等)逐漸清除，形成相對新鮮的、引流通暢的創(chuàng)面，為新生肉芽組織的生長創(chuàng)造有利條件。“祛腐”是“提膿”的目的;“提膿”是“祛腐”的方式和手段。提膿祛腐藥物療法是中醫(yī)的特色和優(yōu)勢。肛腸科常見的感染性疾病(肛周膿腫和肛瘺)的術(shù)后創(chuàng)面都是經(jīng)過一定的手術(shù)清創(chuàng)過程，但是對于深部肛周膿腫及復(fù)雜性肛瘺，前者術(shù)中無法做到徹底清創(chuàng)，后者臨床為了保護(hù)肛門括約肌正常形態(tài)及功能，不可能將瘺管全部切除，如果能夠使用提膿祛腐藥物配合術(shù)后換藥，便能加快創(chuàng)面壞死及病理組織的脫落，縮短創(chuàng)面愈合的時間。再者，某些肛腸手術(shù)切口較小，導(dǎo)致術(shù)后創(chuàng)面引流不暢，局部出現(xiàn)感染或慢性炎性反應(yīng)至胬肉增生時，如果能夠使用提膿祛腐藥物進(jìn)行換藥，便能避免部分術(shù)后并發(fā)癥的發(fā)生。此外，肛腸疾病中藏毛竇、骶前囊腫等疾病，其手術(shù)成功的關(guān)鍵是徹底清除病理組織，但有時由于結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性和種種限制，無法全面徹底地清除這些病理組織，此時如果能夠使用提膿祛腐藥配合術(shù)后換藥，便能夠大大提高治療的成功率［24］。因此，提膿祛腐藥物療法在肛腸科乃至整個中醫(yī)外科學(xué)領(lǐng)域承擔(dān)著非常重要的任務(wù)。

3.2 西醫(yī)對“提膿祛腐法”的認(rèn)識 “提膿祛腐法”是一種濕潤的藥物清創(chuàng)法，與西醫(yī)學(xué)近年發(fā)展起來的“酶學(xué)清創(chuàng)”在方法與效果上相似。兩者雖源于不同醫(yī)學(xué)，但卻殊途同歸［24－28］。

3.3 升丹制劑不良反應(yīng) 升丹制劑在臨床上療效顯著，已沿用千余年，但升丹制劑具有一定的不良反應(yīng)，過量可導(dǎo)致肝腎損害。其主要化學(xué)成份是粗制的HgO及Hg(NO3)2等，屬中等毒性藥物。臨床和實驗表明通過皮膚創(chuàng)面外用升丹制劑都有不同程度的汞吸收，其毒性有蓄積性，造成內(nèi)臟的損害，甚至導(dǎo)致中毒死亡［29－32］。其主要的靶器官是腎臟。

3.4 姜露散全方由姜黃、露蜂房、皂角刺等組成，具有清熱解毒，提膿袪腐之功效 本研究結(jié)果顯示，姜露散組和九一丹組創(chuàng)面膿腐脫落時間均明顯短于模型組(P＜0.01);姜露散組和九一丹組第3 d創(chuàng)面分泌物量計分均明顯高于模型組(P＜0.01)。提示姜露散和九一丹能夠迅速“化腐提膿”，促進(jìn)創(chuàng)面腐肉脫落，將其轉(zhuǎn)化成膿汁，使得創(chuàng)面引流通暢，從而促進(jìn)新生肉芽組織的生長。第3、7 d姜露散組和九一丹組創(chuàng)面肉芽組織中溶菌酶含量均明顯高于模型組(P＜0.01)。溶菌酶含量分布基本表現(xiàn)為先升高后逐漸下降的趨勢，與創(chuàng)面炎性反應(yīng)的時間和程度變化基本一致，而姜露散組與九一丹組第3 d溶菌酶含量就達(dá)到峰值，至第7 d時仍然保持高水平，第14 d顯著下降，且姜露散組溶菌酶含量相對較高，提示姜露散能有效地趨化和活化吞噬細(xì)胞，使得吞噬細(xì)胞能夠迅速聚集在感染創(chuàng)面處，來清除細(xì)菌、中和異物及細(xì)菌所產(chǎn)生的毒素，溶解及清除壞死組織;滲出的蛋白凝固后成為創(chuàng)面的保護(hù)屏障，起到為炎性反應(yīng)細(xì)胞移動提供網(wǎng)架結(jié)構(gòu)等作用。這些作用為下一步的創(chuàng)面修復(fù)打下了良好的基礎(chǔ)。因此，提高創(chuàng)面肉芽組織中溶菌酶的含量以調(diào)節(jié)機(jī)體局部免疫功能可能是姜露散提膿祛腐作用的機(jī)制之一［24，33］。第3、7 d姜露散組、九一丹組創(chuàng)面肉芽組織中IL－1β含量均明顯高于模型組(P＜0.01)。各組創(chuàng)面肉芽組織中IL－1β含量基本在第3 d時達(dá)到峰值，此后逐漸下降，可能與第3 d時炎性性反應(yīng)程度最高有關(guān)。創(chuàng)面肉芽組織中的IL－1β為血管促進(jìn)因子和炎性反應(yīng)因子，能夠刺激創(chuàng)傷修復(fù)早期炎性反應(yīng)，從而促進(jìn)創(chuàng)面的修復(fù)。這可能也是解釋姜露散提膿祛腐的作用機(jī)制之一［24，33］。第7、14 d 血清 BUN、CREA、ALT 含量，九一丹組明顯高于姜露散組和模型組(P＜0.05)。提示姜露散對肝腎功能影響小，用藥安全性優(yōu)于九一丹。

綜上，姜露散可能通過提高創(chuàng)面肉芽組織中溶菌酶含量及創(chuàng)面肉芽組織中IL－1β含量來起到對感染性創(chuàng)面提膿祛腐的作用，其用藥安全性優(yōu)于升丹制劑(九一丹)，為尋找升丹制劑替代品提供更多選擇空間。本次實驗僅從創(chuàng)面肉芽組織中溶菌酶、IL－1β等方面探討姜露散提膿祛腐的作用機(jī)制，如需進(jìn)一步明確其機(jī)制，還有待大樣本的多靶點的研究。

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