柯敏輝 葉 玲 陳立武 吳華嵩 魏 霖 鄭鳴霄

(1福建中醫(yī)藥大學附屬第二人民醫(yī)院，福州，350003;2福建省中醫(yī)藥研究院，福州，350003)

直腸黏膜內(nèi)脫垂(Internal Rectal Prolapse，IRP)是指直腸黏膜層套疊入遠端直腸腔或肛管內(nèi)而未脫出肛門的一種功能性疾病，是常見出口梗阻型便秘的原因之一，以中老年女性較為多見［1］，其發(fā)病率為外脫垂的3～10倍［2］。本文旨在建立 IRP兔模型，為 IRP的治療和基礎研究提供工具。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 動物及分組 30只健康新西蘭兔，1月齡，雌雄各半，體重0.7～0.8 kg，由上海松聯(lián)實驗動物養(yǎng)殖場提供，許可證號:scxk(滬)2007－0011。將30只兔按性別分層，按隨機數(shù)字表隨機分為正常組6只、造模組24只。正常組飼養(yǎng)方法如下:每只兔單籠飼養(yǎng)，照明12 h控制，溫度22～25℃及相對濕度40% ～70%，予150～180 g/d足量顆粒飼料飼養(yǎng)，自由飲水，適應性馴養(yǎng)1周后實驗。造模組在正常組飼養(yǎng)方法基礎上，加入造模方法。兔由福建省中醫(yī)藥研究院動物房統(tǒng)一飼養(yǎng)，對兔的處置符合2006年科學技術部發(fā)布的《關于善待實驗動物的指導性意見》［3］。

1.1.2 藥物及試劑 1)生大黃液的制備。生大黃購自福建中醫(yī)藥大學附屬第二人民醫(yī)院。制備:生大黃1 000 g，4 000 mL自來水浸泡30 min。第1次水煎，沸后20 min倒出。第2、3次各加80℃水2 000 mL，沸后5 min即可倒出。混合3次煎液，紗布過濾濃縮至1 000 mL，配成100%生大黃水煎液。4℃冰箱存貯，臨用溫育。

2)番瀉葉液的制備。番瀉葉購自福建中醫(yī)藥大學附屬第二人民醫(yī)院。制備:200 g番瀉葉浸入100℃1 000 mL自來水，充分攪拌30 min后用紗布過濾出約600 mL。4℃冰箱存貯，臨用溫育。

3)無水乙醇。購自上海南翔試劑有限公司。

1.2 造模方法 采用大黃和番瀉葉灌胃、無水乙醇肛周局部注射與站立三種方法聯(lián)合造IRP兔模型，造模時間2個月。

1.2.1 中藥灌胃 根據(jù)國家衛(wèi)生部《中藥新藥臨床研究指導原則》(1993)［4］和兔的生物學特性，由中藥大黃與番瀉葉聯(lián)合灌胃致兔緩瀉，緩瀉糞便質(zhì)地以1分至3分之間為度(以下兔糞便質(zhì)地評分標準參見表1)。起始每日生大黃液按20 mL/kg灌胃1次。若連續(xù)2日出現(xiàn)3分以上糞便，則生大黃液的灌胃量在之前基礎按5 mL/kg減量。若出現(xiàn)1日0分糞便，則生大黃液的灌胃量在之前基礎上按5 mL/kg追加，追加直至每日30 mL/kg。此后若排1日0分糞便，則在生大黃液灌胃30 mL/kg的基礎上加用番瀉葉液5 mL/kg灌胃。若繼續(xù)排1日0分糞便，番瀉葉液灌胃量在之前基礎上按5 mL/kg追加。若連續(xù)2日出現(xiàn)3分以上糞便，則番瀉葉液在之前基礎上按5 mL/kg減量。連續(xù)每日灌胃2個月。

表1 兔糞便質(zhì)地評分標準

1.2.2 無水乙醇肛周注射 在中藥灌胃前1 d，將兔固定，碘伏消毒兔肛周組織，以1 mL注射器于截石位3、5、6、7、9 點肛門邊緣分別柱狀注射無水乙醇 0.3 ～0.4 mL。注射時需回抽，勿將藥液注入血液，注射深度以1 cm為宜。若注射時兔發(fā)出驚叫等異常聲響立即停止進針，避免驚嚇死亡。若注射時兔后肢突然蹬腿，考慮刺入坐骨神經(jīng)，即時退針。造模期間注射無水乙醇1次。

1.2.3 兔站立 將兔置于兔固定架中，將固定架直立，兔后肢末端需接觸地面，站立5 h。連續(xù)每日站立2個月。

1.3 診斷標準及觀察方法

1.3.1 IRP兔模型診斷標準 根據(jù)兔的生物學特性，參照2002年中華中醫(yī)藥學會肛腸分會制定的直腸脫垂診斷標準［5］和武忠弼［6］等在《中華外科病理學》中描述的直腸脫垂病理征象，確定IRP兔模型診斷標準如下:1)肛鏡檢查見松弛的直腸黏膜遮擋肛鏡視野范圍在3/4以上;2)排便時兔直腸黏膜未脫出肛外;3)直腸壁HE染色鏡下見固有層腺體組織增生，血管擴張充血，間質(zhì)炎細胞浸潤聚集，間質(zhì)水腫、疏松。

1.3.2 觀察方法 1)癥狀與體征。實驗前后觀察兔的神志、飲食、體重、二便、背部及下腹部皮毛情況;觀察兔排便時是否直腸黏膜脫出肛外;肛門鏡下觀察兔直腸黏膜脫垂情況。

2)病理形態(tài)學觀察。實驗2個月后解剖兩組兔直腸，取材距肛管1 cm的直腸組織固定于4%多聚甲醛緩沖液中。常規(guī)石蠟包埋、切片、HE染色行病理學檢查。

2 結果

2.1 癥狀與體征

2.1.1 實驗前 30只兔均反應敏捷，呼吸、飲食、體重正常，排質(zhì)硬成形糞便，排尿正常，兔背毛色光澤，下腹部未見脫毛。肛鏡下兔直腸黏膜未見隆起(參見圖1)。排便時未見兔直腸黏膜脫出。實驗兩組具有可比性。

2.1.2 實驗2個月后正常組 兔存活6只。存活兔均反應敏捷，呼吸、飲食、體重正常，排質(zhì)硬成形糞便，排尿正常，兔背毛色光澤，下腹部未見脫毛。肛鏡下見1只兔直腸黏膜稍隆起(參見圖2)，余5只兔直腸黏膜未見隆起(參見圖1)。排便時均未見直腸黏膜脫出肛外。

2.1.3 實驗2個月后造模組 兔存活17只(其中因連續(xù)幾日急性腹瀉、拒食死亡4只，因注射無水乙醇后肢偏癱、拒食死亡1只，因注射無水乙醇肛周皮下組織壞死、拒食死亡1只，不明原因腹脹、拒食死亡1只)。存活兔嗜臥倦怠，反應欠敏捷，食欲下降，體重下降、消瘦，背毛臟亂、枯槁不榮(參見圖5)，下腹部不同程度的脫毛(參見圖6)，排尿正常，排質(zhì)軟、不成形為主糞便。肛鏡下均可見直腸黏膜隆起、套疊，遮擋肛鏡視野范圍在3/4以上(參見圖3、圖4)。排便時均無直腸黏膜脫出肛外。

2.2 病理形態(tài)學觀察

2.2.1 正常組兔直腸壁HE染色鏡下示 黏膜上皮有序排列，固有層腺體排列齊整，腺上皮細胞分化良好，黏膜肌層至漿膜層比例正常，間質(zhì)未見充血、水腫(參見圖7)。

2.2.2 造模組兔直腸壁HE染色鏡下示 固有層腺體組織增生，血管擴張充血，間質(zhì)炎細胞浸潤聚集，間質(zhì)水腫、疏松(參見圖8－圖12)。

3 討論

《五十二病方》最先記載脫肛病，《神農(nóng)本草經(jīng)》首見該病名［7］?！峨y經(jīng)》云:“病之虛實，入者為實，出者為虛，肛門脫出，非虛而何?”中醫(yī)認為脫肛是由氣虛運化失調(diào)，不能游溢精氣，中氣不足，氣虛不固，內(nèi)臟下脫，年久失治則脫出不納［8］。參照此病機，研究以脾虛氣陷為造IRP兔模型的理論依據(jù)。劉曉玲［9］認為大黃、番瀉葉是制作脾虛氣陷證動物模型的經(jīng)典用藥，故選用大黃、番瀉葉灌胃2個月，久泄傷脾，脾氣虛衰，升舉無力，內(nèi)臟失于舉托致脫肛。兔平素喜四肢著地活動，偶爾站立。久立屬中醫(yī)“五勞”之一，久立將傷骨勞腎，勞累過度易致中氣下陷，故納入久立作為造模方法之一。西醫(yī)認為附著直腸周圍的組織松弛可導致IRP的發(fā)生［10］。肛周局部注射壞死劑無水乙醇，導致末梢神經(jīng)發(fā)生變性，出現(xiàn)傳導功能阻滯［11］，使該神經(jīng)的效應肌發(fā)生功能障礙，達到肛門括約肌張力減弱，肛管松弛引起直腸黏膜下脫。結合中西醫(yī)理論，本研究采用大黃和番瀉葉灌胃、無水乙醇肛周局部注射與站立三種方法聯(lián)合造IRP兔模型。

課題選用1月齡兔為研究對象，因1月齡兔剛離乳，相當于人嬰幼兒期，嬰幼兒氣血未旺、中氣不足易發(fā)生IRP。前期參考相關文獻，運用大黃、番瀉葉灌胃致急性瀉下制作IRP兔模型，結果失敗。失敗的啟示如下:1)連續(xù)排稀便數(shù)日易致幼兔死亡，解剖死亡兔發(fā)現(xiàn)直腸壁以水腫、瘀血為主要表現(xiàn)，未見黏膜脫垂;2)兔與人不同，平素喜排硬便，瀉下糞便應以便質(zhì)軟、不成形為主，不可以稀便為主;3)兔對瀉下中藥易耐受，需逐步加量方可瀉下;4)部分兔易感染而腹瀉死亡，應注意環(huán)境清潔;5)避免幼兔受突然的驚嚇(如噪音等)。此后改進中藥灌胃方案，減少中藥灌胃量并延長灌胃時間，運用緩瀉的方法造模。前期運用兔在跑籠中跑步、站立等方法讓兔疲勞造模，因兔不能適應跑籠中跑步等各種原因，經(jīng)預實驗確定兔站立5 h為造模方法之一。前期運用無水乙醇肛周注射發(fā)現(xiàn):若無水乙醇注入過深，可能刺入坐骨神經(jīng)引起兔后肢癱瘓或刺入腹腔導致兔死亡;若注射過淺在皮下，可能無水乙醇沿皮下浸潤至下腹、骶尾、背部等處，導致浸潤處組織壞死;若注射量多，無水乙醇易浸潤至肛門周皮下，引起組織壞死;若注射量少，可能達不到神經(jīng)阻滯的效果。經(jīng)預實驗確定無水乙醇肛周注射進針約1 cm、量約2 mL為造模方法之一。運用解剖、病理等方法對不同造模時間段的兔進行比對，發(fā)現(xiàn)兩個月為制作IRP兔模型適宜時間段。

在造模標準的制定上，兔的肛鏡檢查標準參照王貴祥［12］、石章鐵［13］等臨床診斷 IRP 的標準制定，從宏觀角度反映直腸黏膜的變化。病理標準參照武忠弼［6］、李鶴文［14］、王振軍［15］等的描述，結合前期對 IRP兔的直腸壁病理分析制定，從腺體、血管、間質(zhì)等顯微角度反映直腸壁結構的改變。運用宏觀與微觀兩種手段來評價IRP兔模型具有可行性。但本研究存在不足之處:1)提高兔的存活率。需要從避免急性腹瀉的發(fā)生、提高無水乙醇的注射技術(避免注入肛周皮下間隙或刺入坐骨神經(jīng))等方面入手。2)模型的穩(wěn)定性，IRP兔外因去除后是否存在自愈的可能需進一步研究。

綜上，本研究運用聯(lián)合方法造模，可重復性強，為IRP的進一步探討和研究提供了良好的模型和實驗依據(jù)。

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