劉仁慧 康 學 張偉華 周 琦 王秀娟

(1首都醫(yī)科大學中醫(yī)藥學院，北京，100069;2上海中醫(yī)藥大學附屬岳陽中西醫(yī)結合醫(yī)院中醫(yī)科，上海，200437;3首都醫(yī)科大學附屬北京中醫(yī)醫(yī)院內(nèi)科門診，北京，100010)

糖皮質(zhì)激素(glucocorticoid，GC)由于其重要而有 效的免疫抑制及抗炎效果而被廣泛應用于臨床多種疾病的治療，但長期應用GC所誘發(fā)的骨質(zhì)疏松癥已成為繼絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松和退行性骨質(zhì)疏松之后最常見的藥源性骨病，且GC劑量越大、療程越長，自發(fā)性骨折的發(fā)生率就越高［1］。從中醫(yī)角度而言，GC為外源性“純陽”“邪熱”之品，長期大量作用于人體后導致腎失封藏，腎之陰陽失衡，腎精虧虛無以充實骨骼，骨失濡養(yǎng)而形成骨質(zhì)疏松［2］，治宜補腎填精壯骨之法。中藥淫羊藿、女貞子配伍可平補陰陽、益精壯骨，故二者配伍較單味藥應用更切合GIOP的中醫(yī)發(fā)病機制。已有大量文獻報道［3］單味淫羊藿、女貞子及相關復方在防治骨質(zhì)疏松方面取得顯著效果，但尚未聞二者配伍防治GIOP的報道。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，淫羊藿、女貞子配伍后對哮喘大鼠應用糖皮質(zhì)激素地塞米松治療后導致的骨代謝異常起到明顯的保護作用［4］。本實驗過觀察淫羊藿女貞子對激素誘導骨質(zhì)疏松模型大鼠骨代謝生化指標的影響，探討二藥配伍對骨代謝異常的改善作用，為防治GIOP的進一步研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 動物 清潔級健康SD大鼠，雌雄各半，體重(200±20)g，由北京維通利華實驗動物技術股份有限公司提供，合格證號:SCXK(京)2007－0001。

1.1.2 試劑與藥品 地塞米松磷酸鈉注射液(天津藥業(yè)焦作有限公司，批號:10081711);淫羊藿、女貞子中藥材(購于北京同仁堂藥店);AKP、StrACP、Ca、P測定試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號分別為:20110326、20110329、20110330、20110330);BGP 放免試劑盒(北京原子高科股份有限公司，批號:201112)。

1.1.3 儀器 XH6080放免儀(西安核儀廠);721分光光度計(日本島津公司);紫外分光光度計(SHIMADZU，UV －1700);離心機(Heraeus Biofuge 15R)。

1.2 實驗方法

1.2.1 分組 按隨機數(shù)字表法分為6組:正常對照組、模型對照組、女貞子組、淫羊藿組、淫羊藿女貞子組、鈣爾奇組(陽性對照組)，每組10只，自由飲水、攝食。

1.2.2 造模及給藥 參考文獻［5］，除正常對照組外，其余各組大鼠分別給予兩大腿內(nèi)側交替肌肉注射地塞米松1 mg/kg體重，2次/周，共計8周，正常對照組大鼠給予等體積的生理鹽水。在造模的同時，各組動物灌胃給予相應的藥物或生理鹽水，1次/d，共計8周。1)淫羊藿組:淫羊藿水煎液9.5 g/kg體重灌胃;2)女貞子組:女貞子水煎液9.5 g/kg體重灌胃;3)淫羊藿女貞子組:淫羊藿女貞子(4∶3)水煎液9.5 g/kg體重灌胃;4)鈣爾奇組:鈣爾奇碳酸鈣D3片0.277 3 g/kg體重灌胃，1次/d;5)正常對照組、模型對照組:灌服與用藥組等體積的生理鹽水。

1.2.3 取材處理 大鼠腹腔麻醉，腹主動脈取血，離心取血清，用于血清生化指標的檢測;完整分離大鼠股骨，剔除所有附著的肌肉和結締組織，用生理鹽水浸泡的濕紗布包裹，－20℃密封保存，用于骨Ca、P的測定。

1.2.4 觀察指標及檢測方法 1)大鼠一般情況觀察:每周兩次稱重，觀察大鼠體質(zhì)量變化、精神狀況、攝食飲水及活動情況、毛發(fā)光澤度、二便、存活率等。2)血清 AKP、StrACP、Ca、P 含量:按照試劑盒說明書，均采用比色法檢測。3)血清BGP含量:按照試劑盒說明書，采用放免法檢測。4)骨Ca、P含量:將剔凈的大鼠股骨于100℃烘箱干燥，取干燥的股骨段加入10%三氯乙酸5 mL，脫鈣24 h后傾出脫鈣液留存，再加入10%三氯乙酸5 mL脫鈣24 h，合并兩次脫鈣液，按試劑盒說明書分別測定Ca、P含量。

2 實驗結果

2.1 大鼠一般情況 在激素造模過程中，模型對照組大鼠逐漸出現(xiàn)體質(zhì)量增長緩慢，懶動少食，毛被稀疏無光澤，弓腰塌背，喜蜷縮聚堆，便軟或有便溏等現(xiàn)象;各給藥組情況較模型對照組均有所改善，以淫羊藿女貞子組改善作用最佳。實驗前后大鼠體重結果顯示:實驗開始時各組體重均無差異;實驗結束時，模型對照組大鼠體重較正常對照組顯著下降(P＜0.01)，而各用藥組體重均較模型對照組有所升高，以淫羊藿女貞子組升高最為顯著，結果有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。(表1)

表1 各組大鼠實驗前后體質(zhì)量的比較(s)

表1 各組大鼠實驗前后體質(zhì)量的比較(s)

注:與正常對照組比較，＊＊P＜0.01;與模型對照組比較，*P＜0.05;與淫羊藿女貞子組比較，△△P＜0.01。

10 206.30±4.08 425.40±30.52模型對照組 10 208.70±6.00 298.10±76.67＊＊女貞子組 10 207.70±5.72 359.10±15.55△△淫羊藿組 10 206.30±4.99 340.10±33.35△△淫羊藿女貞子組 10 207.20±6.29 403.20±6.61*鈣爾奇組 10 207.70±5.93 339.50±16.93正常對照組△△

2.2 各組大鼠血清AKP、StrACP、BGP含量的比較模型對照組血清AKP、StrACP活性較正常對照組顯著升高，BGP含量顯著降低(均P＜0.01)。與模型對照組比較，女貞子組、淫羊藿組、淫羊藿女貞子組及陽性藥組均可明顯下調(diào)血清AKP、StrACP水平(P＜0.05或0.01)，且各給藥組血清BGP含量顯著升高(均P＜0.01)，其中以淫羊藿女貞子組作用最為顯著。(表2)

表2 各組大鼠血清AKP、TRAP、BGP的比較(s)

表2 各組大鼠血清AKP、TRAP、BGP的比較(s)

注:與正常對照組比較，＊＊P＜0.01;與模型對照組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01;與淫羊藿女貞子組比較，▲▲P＜0.01。

組別 只數(shù) AKP(金氏單位/100 mL)TRAP(U/L)BGP(pg/mL)10 26.00±3.27 5.79±2.28 6.84±0.90模型對照組 10 32.89±6.32＊＊ 10.51±3.43＊＊ 1.97±0.64＊＊女貞子組 10 25.88±4.82△△▲▲ 6.92±1.90△△ 3.68±1.07△△▲▲淫羊藿組 10 27.17±6.19△▲▲ 8.40±1.49△ 5.80±1.09△△▲▲淫羊藿女貞子組 10 17.13±4.82△△ 6.48±1.02△△ 6.84±0.61△△鈣爾奇組 10 20.28±6.82△△ 8.29±2.47△ 4.23±0.66正常對照組△△▲▲

2.3 各組大鼠血及骨Ca、P含量的比較 與正常對照組比較，模型對照組血及骨Ca含量顯著降低(均P＜0.01)，血P含量顯著升高(P＜0.01)。與模型對照組比較，各用藥組血及骨Ca含量均有升高趨勢，血P含量有下降趨勢，其中以淫羊藿女貞子組及陽性藥組作用最為顯著，結果有統(tǒng)計學意義(均P＜0.01);各組間骨P含量差異無統(tǒng)計學意義。(表3)

表3 各組大鼠血Ca、P含量的比較(s)

表3 各組大鼠血Ca、P含量的比較(s)

注:與正常對照組比較，＊＊P＜0.01;與模型對照組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。與淫羊藿女貞子組比較，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01。

組別 只數(shù) 血Ca(mmol/L)血P(mmol/L)骨Ca(mmol/g prot)骨P(mmol/g prot)10 2.74±0.40 1.58±0.23 6.61±1.06 2.44±0.13模型對照組 10 1.93±0.30＊＊ 2.18±0.35＊＊ 4.50±0.50＊＊ 2.54±0.16女貞子組 10 2.26±0.32▲▲ 1.90±0.24△ 5.22±0.86▲ 2.41±0.19淫羊藿組 10 2.44±0.41▲ 1.97±0.20 5.33±0.83△ 2.50±0.18正常對照組2.40±0.18淫羊藿女貞子組 10 3.08±0.23△△ 1.86±0.24△△ 6.01±0.86△△ 2.41±0.15鈣爾奇組 10 2.78±0.15△△ 1.78±0.25△△ 6.20±1.03△△

3 討論

隨著GC在腎臟疾病、器官移植、哮喘及炎性疾病等領域的廣泛應用，由于其長期、超生理劑量使用而引發(fā)的GIOP已成為最常見的藥源性骨病，其發(fā)病率僅次于絕經(jīng)后及老年性骨質(zhì)疏松癥而位居第三位［6］，大約90%長期使用GC者，有明顯骨量丟失，骨折發(fā)生率增加。因此，GIOP已成為現(xiàn)代醫(yī)學亟待解決的重要問題?？v觀目前GIOP的治療藥物，西醫(yī)多采用二磷酸鹽類、降鈣素、維生素D聯(lián)合鈣制劑以及激素替代療法等［7］，雖有一定的療效，但存在價格昂貴、不良反應大、單純應用無效多需聯(lián)合使用等缺點，對于GIOP這一復雜的病變而言，顯然難奏長期之效。相對于西醫(yī)治療的弊端，中醫(yī)藥治療本病著重調(diào)動內(nèi)因，辨證論治，具有多途徑、多靶點的整體調(diào)節(jié)作用，最終達到糾正機體激素失衡和負鈣平衡的功效;又以其不良反應小，治療價格低，遠期療效佳等優(yōu)勢，在治療本病方面具有廣闊的應用前景。

中醫(yī)學認為腎為先天之本，藏精主骨生髓，正如《素問·生氣通天論》所言:“腎者，主蟄，封藏之本，精之處也，其充在骨。”即骨骼的生長、發(fā)育、枯榮與腎之精氣盛衰密切相關，腎精充實則骨髓化生有源，骨得其養(yǎng)則堅固有力;若腎精虧虛則骨髓化生乏源，骨失其養(yǎng)就會出現(xiàn)骨骼脆弱，腰背疼痛，脛膝酸軟等癥狀。中醫(yī)學認為激素作為外源性“純陽”“邪熱”之品，能啟動人體“藏精而起亟”功能，耗損陰精以激發(fā)元陽之氣外出應變，對抗疾病。使用日久，陽氣過度外出而不潛降，終致腎之封藏失司，腎精耗損，陰陽失衡［8］;腎精虧虛無以充實骨骼，骨失濡養(yǎng)而引發(fā)骨質(zhì)疏松。本實驗通過觀察發(fā)現(xiàn)，模型對照組大鼠逐漸出現(xiàn)體質(zhì)量增長緩慢，懶動少食，毛被稀疏無光澤，弓腰塌背，喜蜷縮聚堆，便軟或便溏等一系列證候，提示激素的長期作用可造成大鼠腎之陰陽失衡，腎虛精虧。針對GIOP的發(fā)病機制，治宜補腎填精壯骨之法。中藥淫羊藿溫補腎陽、強筋骨，女貞子滋補肝腎、強腰膝，二藥配伍可平補陰陽、益精壯骨。本實驗生物學表征觀察顯示，淫羊藿、女貞子各給藥組均可明顯緩解激素致骨質(zhì)疏松模型大鼠腎虛狀況，使大鼠體質(zhì)量增加，其中以淫羊藿女貞子組改善作用最為明顯，提示二者配伍更切合GIOP的中醫(yī)發(fā)病機制，作用效果較單味藥更佳。

骨代謝生化指標具有敏感性高、特異性強等優(yōu)點，可動態(tài)觀察異常骨代謝過程和治療效果，快速、靈敏地反映骨轉(zhuǎn)換狀態(tài)，對評價骨質(zhì)量、監(jiān)測藥物療效、預測骨密度和骨質(zhì)疏松引起的骨折、鑒別診斷代謝性骨病等有著重要的意義［9］。血清BGP濃度可特異性地反映母體成骨細胞的活性，可作為評價骨形成的重要指標［10］。此外在骨吸收過程中，基質(zhì)中的BGP又可釋放到血液中，因此BGP水平又可作為判斷骨轉(zhuǎn)移，衡量骨轉(zhuǎn)換率的特異性指標［11］。成骨細胞是GC作用的主要位點，研究表明［12］，GC主要是通過GC受體(GR)介導與成骨細胞靶基因的糖皮質(zhì)激素受體反應元件(GREs)結合，抑制成骨細胞增殖分化，影響成骨細胞功能，促進成骨細胞凋亡，最終使骨形成減少，骨量降低，引發(fā)骨質(zhì)疏松。本實驗結果顯示，模型對照組大鼠血清BGP含量較正常對照組顯著降低(P＜0.01)，提示GC可明顯抑制成骨細胞活性，使骨形成減少;而與模型對照組比較，各用藥組血清BGP含量顯著升高(均P＜0.01)，其中以淫羊藿女貞子組升高最為顯著，提示淫羊藿、女貞子可使BGP分泌增加，減弱激素對成骨細胞的抑制，使成骨細胞活性增強，促進骨形成，且二藥配伍應用較單味使用效果更佳。

AKP是反映骨代謝的靈敏指標，破骨或成骨占優(yōu)勢均升高，骨更新率增加的代謝性骨病血清AKP顯著升高。實驗結果顯示，模型對照組大鼠血清AKP含量較正常對照組顯著升高(P＜0.01)。與模型對照組比較，女貞子組、淫羊藿組、淫羊藿女貞子組及陽性藥組均可明顯下調(diào)血清AKP水平(P＜0.05或0.01)，其中以淫羊藿女貞子組作用最為顯著。提示淫羊藿、女貞子對GC引起的AKP活性升高有拮抗作用，可有效糾正血清AKP水平的異常。

GC除了對成骨細胞的抑制作用外，還可直接激活破骨細胞功能，或通過某些生長因子及細胞因子的間接作用影響破骨細胞的活性，使骨吸收增強［13］。StrACP參與骨基質(zhì)中Ca、P礦化底物的降解及骨吸收窩陷的形成，由此被認為直接參與破骨細胞骨吸收過程［14］。由破骨細胞產(chǎn)生的StrACP可進入血液循環(huán)，故檢測血清中StrACP的水平可以反映體內(nèi)破骨細胞活性和骨吸收狀態(tài)。本實驗中，模型對照組大鼠血清StrACP活性較正常對照組顯著升高(P＜0.01)，提示GC可刺激破骨細胞，使其活性增強，骨吸收加快;與模型對照組比較，淫羊藿、女貞子各給藥組均可顯著下調(diào)血清StrACP水平(P＜0.05或0.01)，其中淫羊藿女貞子組下調(diào)作用最為顯著(P＜0.01)，提示淫羊藿、女貞子對激素引發(fā)的StrACP水平升高有拮抗作用，可降低破骨細胞活性，從而有效抑制骨吸收，且二藥配伍應用作用更顯著。

Ca和P是骨骼的主要構成元素，骨代謝其實就是機體內(nèi)Ca、P代謝，即骨組織不斷地將儲存的Ca、P釋放入血，使血Ca、P含量升高，同時又將血中Ca、P回存于骨骼中，以保證骨礦代謝的穩(wěn)態(tài)［15］。Ca與P的過度丟失和吸收不佳會致使骨代謝失調(diào)，引起骨質(zhì)疏松。實驗結果顯示，模型對照組血及骨Ca含量顯著降低(均P＜0.01)，血P含量顯著升高(P＜0.01)，而與模型對照組比較，各用藥組血及骨Ca含量均有升高趨勢，血P含量有下降趨勢，其中以淫羊藿女貞子組及陽性藥組作用最為顯著，提示淫羊藿、女貞子可明顯升高血及骨Ca含量，血Ca水平的升高有助于新骨的形成和鈣化，同時抑制骨Ca向血液轉(zhuǎn)移，減少機體骨量的丟失;同時下調(diào)血P水平，以保持各種無機元素的代謝平衡，從而有效地糾正了GC所導致的Ca、P代謝紊亂，達到治療骨質(zhì)疏松的目的。

綜上所述，淫羊藿、女貞子可明顯改善地塞米松致骨質(zhì)疏松模型大鼠骨代謝生化指標，有效糾正骨代謝異常，對糖皮質(zhì)激素性骨質(zhì)疏松起到一定的防治作用，其中以二者配伍應用效果更佳。

［1］劉亞偉.糖皮質(zhì)激素性骨質(zhì)疏松的發(fā)病機制及治療進展［J］.國外醫(yī)學泌尿系統(tǒng)分冊，2004，24(5):711 －715.

［2］張軍.糖皮質(zhì)激素性骨質(zhì)疏松癥的中西病機及封髓潛陽微粉作用機制研究［D］.成都中醫(yī)藥大學，2006.

［3］康學，劉仁慧，王秀娟.淫羊藿、女貞子抗骨質(zhì)疏松癥的應用與機制研究進展［J］.中國實驗方劑學雜志，2012;18(21):331－334.

［4］劉仁慧，王秀娟，袁穎，等.淫羊藿、女貞子對激素干預哮喘大鼠骨代謝的影響［J］.吉林中醫(yī)藥，2012，32(5):490 －492.

［5］楊志剛，沈宗根，顧震綸，等.WHE抑制地塞米松致大鼠骨質(zhì)疏松研究［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學，2008，36(29):12708 －12710.

［6］Mazziotti G，Giustina A，Canalis E，et al.Glucocorticoid － induced osteoporosis clinical and therapeutic aspects［J］.Arq Bras Endocrinol Metabol，2007，51(8):1404 －1412.

［7］廖二元.糖皮質(zhì)激素所致骨質(zhì)疏松癥的預防和治療［J］.藥品評價，2012，9(7):28 －35.

［8］王劍，鄭洪新，劉瑞輝，等.糖皮質(zhì)激素影響成骨細胞分化及補腎中藥的調(diào)節(jié)機制［J］.實用中醫(yī)內(nèi)科雜志，2012，26(1):4 －7.

［9］肖恩.骨質(zhì)疏松骨代謝生化指標的研究進展［J］.中國骨質(zhì)疏松雜志，2008，14(3):212 －216.

［10］孟昭亨.骨鈣素及其臨床意義［J］.中華內(nèi)分泌代謝雜志，2006，8(1):41.

［11］劉梅潔，潘靜華，李艷，等.左歸丸對糖皮質(zhì)激素所致骨質(zhì)疏松大鼠血清中BGP，IGF－I含量的影響［J］.中國實驗方劑學雜志，2011，17(16):133－136.

［12］Moutsatsou P，Kassi E，Papavassiliou AG.Glucocorticoid receptor signaling in bone cells［J］.Trends Mol Med，2012，18(6):348 －359.

［13］賀茂林.糖皮質(zhì)激素性骨質(zhì)疏松癥的研究進展［J］.中國骨質(zhì)疏松雜志，2009，15(6):466 －470.

［14］高俊，張前德.“腎主骨”理論與破骨細胞骨吸收［J］.中醫(yī)雜志，2012，53(7):547 －549.

［15］岳南，只德廣，趙益桂，等.骨康寧沖劑治療骨質(zhì)疏松的藥效學研究［J］.現(xiàn)代藥物與臨床，2009，24(4):227 －231.