杜 博 何福明 王小祥＊,

(1浙江大學材料科學與工程系，杭州 310027)

(2浙江大學醫(yī)學院附屬口腔醫(yī)院種植科，杭州 310006)

遷移、附著、增殖與分化是成骨細胞形成新骨的3個重要步驟，同時也是生物材料表面骨整合的關鍵[1]。最近許多研究表明除了自身成分外，生物材料表面拓撲形貌(尤其是納米尺寸形貌)對細胞的這一過程有很大的影響[1-5]。特殊的納米結構甚至能使吸附于其表面的細胞分化為特殊的形貌[2]。另一方面，磷酸鈣骨科植入材料的降解性能和表面潤濕性是其生物活性的重要參數(shù)，對成骨細胞的吸附、增殖與分化會起到重要的作用[6-8]。因此，設計具有特殊表面拓撲形貌(特別是納米分層等級結構)，并具有優(yōu)越的表面潤濕性與合適的溶解性的磷酸鈣骨科植入材料，具有十分重要意義。

金屬純鈦具有優(yōu)異的力學性能和生物相容性[9-11]，被廣泛用于制造人工關節(jié)、牙種植體。它的缺點是短期內(nèi)不能與骨形成牢固結合。目前的解決對策是在鈦金屬表面涂覆羥基磷灰石(HA)涂層。鑒于等離子噴涂HA涂層固有的問題[12-14]，可吸收的HA涂層近年來得到了特別的重視[15-16]。我們實驗室近些年來開展了牙種植體表面電化學法制備可吸收HA涂層的系列研究工作[11,15,17-23]，動物實驗表明具有明顯的提高早期界面結合強度的作用[24-27]。

電化學沉積法成本低、實驗條件易調(diào)控，尤其是能在形狀復雜金屬基體表面均勻沉積涂層[17,28]。此外，電化學法沉積法還可以用來制備各種成分摻雜的HA[15,17-19,22-23]，進一步提高其生物學特性。但是使用電化學沉積法制備具有特殊微納拓撲形貌HA涂層的報道很少。我們通過兩次電化學沉積法，首先在低濃度的Ca、P電解液中沉積微米尺度的HA棒，然后在高濃度的電解液中在HA棒表面沉積納米尺度的HA叉刺，獲得了荊棘狀微納HA涂層。以期該涂層在表面拓撲形貌、溶解性和表面潤濕性等綜合性能上具有改變成骨細胞生物學行為的性能。本文先期報導該涂層的制備方法、微觀結構和基本理化性能。

1 實驗方法

尺寸為10 mm×10 mm×1 mm的電化學沉積用鈦試樣切割自1 mm厚的商業(yè)純鈦板。試樣表面先后用400#和800#SiC砂紙打磨，然后放入VHF∶VHNO3∶VH2O=1∶3∶10 的混合酸液中表面酸蝕 1 min， 最后使用去離子水超聲振蕩清洗3 min,表面吹干待用。使用分析純試劑 (國藥化學試劑有限公司)CaCl2、NH4H2PO4、NaCl、Na3Cit(檸檬酸鈉)配制電解液。 第一步電沉積電解液中 Ca2+、H2PO4-的濃度分別為1．2 mmol·L-1、0．72 mmol·L-1； 第二步電沉積的電解液中 Ca2+、H2PO4-、Na3Cit濃度分別為 9．6 mmol·L-1、5．76 mmol·L-1、38．4 mmol·L-1。 2 個電解液的 nCa/nP=1．67，且都使用NaCl增強導電性，NaCl濃度恒定在0．1 mol·L-1。電化學沉積在 CHI1140A 型電化學工作站的恒壓模式下進行，鉑作陽極，鈦片試樣作陰極，兩電極間距離為2 cm。第一步沉積的電壓為-3．0 V，沉積時間60 min，電解液溫度為85℃；第二步沉積電壓為-3．4 V，沉積時間35 min，電解液的溫度為60℃。沉積好的涂層使用去離子水清洗，并放在干燥器中晾干(記作THA)。部分試樣只經(jīng)過第一步沉積(記作RHA)，用于對比分析。

使用XPert PRO X射線衍射儀(Cu Kα,管壓40 kV，管流 40 mA，步長 0．020°，掃描速度 4°·min-1)對涂層物相進行測定；使用TENSOR27(BRUKER公司，德國)掠角反射GIR型傅立葉變換紅外光譜儀檢測涂層中存在的化學基團；使用場發(fā)射掃描電子顯微鏡對涂層形貌進行觀察；FEI～TECNAI G2 F20型透射電子顯微鏡(加速電壓200 kV)，對涂層進行微區(qū)的結構分析。

用Ca離子釋放速度評價涂層溶解速率。分別將RHA和THA 2種樣品(各5片)浸泡在10 mL磷酸緩沖溶液(PBS,Biowhittaker)中，維持緩沖液pH值在7．4左右；37℃恒溫箱中，每隔24 h使用相同體積的PBS溶液完全替換原浸泡液，并將替換出的10 mL PBS溶液保存，重復進行21 d；最后使用原子吸收光譜儀(AAS,上海精研PI AA320N)測量保存的所有溶液中的Ca2+濃度。

使用懸滴法測量材料表面接觸角，表征涂層的潤濕性。室溫下，使用接觸角測試儀(上海校倫信息科技有限公司，SL200B)的滴形分析系統(tǒng)，分別測量THA和RHA 2種樣品與去離子水的接觸角，并使用統(tǒng)計學的t檢驗法對2種樣品接觸角進行差異度分析(平均數(shù)，標準偏差，樣本數(shù)為 6，p＜0．05)

2 結果與討論

2.1 涂層制備和組織結構分析

圖1為RHA與THA的表面形貌的SEM圖片。從圖中明顯看出，RHA具有典型的正六邊形截面的棒狀形貌，且棒的橫截面尺寸為100～200 nm。 由THA的SEM圖片可知，其形貌完全異于之前報道的鈣磷涂層結構[18-20,29-33]；對比RHA可知，THA的形貌是在原有HA棒狀結構的基礎上呈現(xiàn)出明顯的叉刺結構。這種荊棘狀結構相比于

一次電化學沉積所得的光滑的六方柱結構(RHA形貌)，表面變得粗糙。進一步觀察，叉刺部晶體的長度在50～100 nm，這大大增加了整個涂層的比表面。THA微納級多級尺寸及高的比表面積大大增加了成骨細胞等的吸附面積，對骨愈合能力的提高有潛在的幫助。

RHA與THA的XRD圖如圖2所示。對比2種涂層的XRD圖，并未發(fā)現(xiàn)明顯差異。比照國際標準卡片 (PDF卡片)，2種涂層的XRD圖里的衍射峰均與HA的特征衍射峰對應,表明2種涂層均由HA構成。

分別對2種涂層進行表面紅外分析，進一步確認其化學成份，結果如圖3所示。在表面紅外譜圖中，RHA與THA具有相同的基本振動峰型：PO43-六個明顯的紅外特征振動峰 (ν1,962cm-1；ν3,1095cm-1，1 055 cm-1，1 035 cm-1；ν4,605 cm-1，568 cm-1)與 OH-的紅外伸縮特征振動峰(ν,3578 cm-1)。

對THA而言，紅外譜圖中還具有獨特的COO-紅外特征振動峰(1 405 cm-1,1 595 cm-1)[29]，但COO-的特征峰強度不高，這可能是由于第二步電化學沉積過程中使用了含有Na3Cit電解液，Na3Cit鹽表面吸附或部分摻雜在枝杈狀形貌結構中的結果。此外兩種涂層的紅外圖譜中也有微弱的CO32-的紅外特征峰(ν:1 479 cm-1，1 422 cm-1，876 cm-1)，這可能是由于涂層制備過程中CO2表面吸附的原因[34]。

用透射電鏡進一步分析了THA的微結構，結果如圖4所示。圖4a顯示了THA獨特的荊棘狀形貌；圖4b為主干棒部位的電子衍射花樣，這是典型的HA單晶電子衍射花樣，說明主干棒部分由HA單晶構成。對其標定后表明，衍射花樣屬＜111＞晶帶軸，HA 的(011)、(110)、(101)晶面；叉刺部位的電子衍射花樣由多個多晶環(huán)構成(圖4c)，說明是多晶結構。通過半徑比標定了5個距中心較近、較清晰的同心環(huán)，它 們分 別對 應 為 HA 的 (100)、(201)、(121)、(113)、(104)晶面。圖4d與圖4e分別為圖4a中方框與圓圈部位的HRTEM照片，其中圖4d對應的棒狀部位的晶格條紋，呈現(xiàn)出規(guī)則的清晰的特點，進一步選取3個方向的平行條紋，并分別計算其間距，分別約為d1≈0．526 nm、

d2≈0．541 4 nm，d3≈0．493 6 nm。 條紋間距分別與 HA 的(101)、(011)、(110)面對應；對比圖 4e，明顯發(fā)現(xiàn)，叉刺部位的晶格條紋不是連續(xù)一致的，而是由多個尺寸約10 nm的區(qū)域構成，不同區(qū)域晶格取向各異，這說明叉刺并不是單晶結構，而是多晶結構，這與電子衍射花樣是一致的。

綜合以上分析，通過兩步電化學沉積法制備得到的具有荊棘狀微納形貌的涂層由羥基磷灰石單一物相組成，其中棒狀結構是由HA單晶構成，叉刺狀結構是由納米多晶HA構成。

2.2 涂層形成分析

在電化學沉積HA過程中，陰極表面發(fā)生H+的還原反應生成OH-：

隨著OH-生成陰極附近pH升高，陰極附近電解液局部達到形成HA的過飽和狀態(tài)，從而形成沉淀:

本研究中得到的THA由兩次電化學沉積而成。第一步電化學沉積制備的HA是單純的棒狀，THA的叉刺是在棒狀基礎上形成的，叉刺的長度與橫截面尺寸都明顯小于主干棒。這可能與第二步電化學沉積采用的高濃度鈣磷電解液、較高的電化學沉積電壓相對低的沉積溫度、以及電解液中含有的Na3Cit等因素有關。

首先，陰極附近pH值大小主要決定于OH-的生成速率，而OH-的生成速率主要取決于電化學沉積過程中的工作電流。對比兩步電化學沉積，采用了不同的工作電壓，其中第二步工作電壓明顯高于第一步，這必然導致第二步沉積過程工作電流升高，進而加快了單位時間內(nèi)形成的OH-速率，提高HA的過飽和度[29,35-36]；與此同時，第二步電沉積使用了高濃度鈣磷電解液，這進一步提高了HA的過飽和度，從而提高了形核速率。此外，在第二步電沉積過程中低的反應溫度則不利于已形成晶核的生長。高的形核速率與低的生長速率共同作用，使得第二步沉積得到細小的HA晶粒。

其次，檸檬酸根離子對第二步沉積時叉刺的生成起到了關鍵的作用。我們的實驗表明，只有在電解液中含有較高濃度的Na3Cit時才能生成叉刺狀結構，不含檸檬酸根的電解液無論如何也不能生成叉刺狀結構。檸檬酸根含有羥基與羧基兩種官能團，能與HA表面的羥基和磷酸基鍵合[29,37]。Martin[29]等研究認為，檸檬酸根離子傾向于在HA的a、b面上吸附。這使得第一層HA表面在第二步電化學沉積開始時附帶大量具有負電荷的，與此同時，也使得在第二步高工作電壓下形成的新的HA晶核表面附帶大量的負電荷，因此第二步電化學沉積并非在第一步的棒狀羥基磷灰石基礎上外延生長，維持原有的棒狀結構。 除此之外，很多研究也表明[29,38-39]，檸檬酸根、EDTA或非晶磷酸鈣等的存在，會改變原有羥基磷灰石形核再生長形成機制，使其通過介晶自組裝生長機制形成。結合本實驗，HA在高的陰極局部飽和度下迅速形核，并在Cit3-的協(xié)助下[29]，聚集為低晶化度的納米組裝單元，進而形成具有一定取向的納米顆粒聚集結構；于此同時，這種納米顆粒聚集結構也被吸附于棒狀HA上的Cit3-吸附，從而形成了枝杈形貌的雛形。隨著電化學繼續(xù)進行，納米顆粒聚集結構中的亞單元邊界融合，Cit3-全部或者大部分從聚集結構和交接處排出(傅里葉紅外分析中的COO-集團特征峰，可以協(xié)助佐證Cit3-在第二步電沉積中的作用)，從而最終形成具有荊棘狀結構的羥基磷灰石棒。

2.3 理化性能分析

使用統(tǒng)計學t檢驗處理懸滴法測量的材料表面接觸角實驗結果，如圖5所示。從圖中看出，THA與RHA兩涂層的平均接觸角大小分別為8.29°與13.68°，前者明顯小于后者(P≈0.002，＜0.05)。 這說明THA的潤濕性明顯高于RHA。這可能在后期植入體內(nèi)后對成骨細胞的吸附、分化與生長的起到促進作用。

THA與RHA兩涂層的鈣離子釋放曲線如圖6所示。從圖中可以看到，兩涂層隨著浸泡時間的延長，Ca2+釋放總量均相應增加。但是對每天的Ca2+釋放量而言，THA明顯高于RHA，即THA具有更快的Ca2+釋放速率。THA較快的溶解特性應該與其特殊的形貌和微觀結構有關。首先，表面叉刺的生成顯著提高了RHA的比表面積，有利于Ca2+溶解與釋放；其次，根據(jù)TEM分析可知，THA的叉枝部分具有納米多晶結構，顯然多晶結構的THA較單晶狀RHA具有更高的Ca2+溶解速率[40-41]。這兩個因素的共同作用，使得THA涂層在磷酸緩沖溶

液中較之RHA涂層具有更高的降解速率。可以想見，當THA棒的外層納米多晶叉刺降解完畢后就會露出內(nèi)部的單晶棒，Ca、P的釋放速度就會隨之降低。就總體而言，THA涂層將具有前期溶解速度快，后期長效慢速溶解的特性，這是一般RHA不具備的。這種溶解特性可能有利于植入體內(nèi)后涂層生物學性能的發(fā)揮。

3 結 論

在不同電解液中，采用兩步電化學沉積方法制備獲得了具有分層等級結構的荊棘狀微納HA棒。HA棒的主干是由直徑約100 nm的HA單晶構成，叉刺為納米多晶結構。電解液濃度、電沉積電壓、沉積溫度以及檸檬酸根對這種荊棘狀微納結構的形成起到了關鍵作用。該荊棘狀微納HA棒具有較好的潤濕性能，以及異于一般HA棒的優(yōu)異的溶解性能，有望在植入人體后增強對成骨細胞的吸附、分化與增長的調(diào)節(jié)作用，提升與骨組織的愈合能力。

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