龍 沁 周大利 張 翔 衛(wèi)冬娟 柳淑婧 陳冬寧

(四川大學(xué)材料科學(xué)與工程學(xué)院，成都 610064)

0 引 言

磷灰石-硅灰石生物玻璃陶瓷(Apatitewollastonite bioactive glass ceramic，A-W GC) 雖具有較好的力學(xué)性能和生物活性，但與羥基磷灰石材料類似，其表面由于不具有作為生物信號(hào)的官能團(tuán)，不能與細(xì)胞產(chǎn)生良好的相互作用[1]。氨基酸是組成蛋白質(zhì)等生物大分子的基本結(jié)構(gòu)單元，谷氨酸是一種酸性氨基酸，分子內(nèi)含兩個(gè)羧基，在生物體內(nèi)的蛋白質(zhì)代謝過程中占有重要地位，參與動(dòng)物、植物和微生物中的許多重要化學(xué)反應(yīng)。眾多研究表明，骨組織工程材料的表面特性能直接影響到材料的生物相容性，人工合成的骨組織工程材料絕大多數(shù)親水性較強(qiáng)，利于細(xì)胞黏附，但細(xì)胞在材料表面生長(zhǎng)，需吸附蛋白質(zhì)，這又要求材料具有一定的疏水性，因此需借助材料表面改性及表面修飾技術(shù)，引入一定基團(tuán)，調(diào)整材料表面親/疏水平衡值以滿足細(xì)胞黏附及生長(zhǎng)的需要。比如在材料表面固定某些蛋白質(zhì)或活性因子，提高材料與細(xì)胞間相互作用，使細(xì)胞更好地在材料表面黏附，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞的增殖和分化[2-6]。目前廣泛使用的材料表面修飾法有物理包被法、化學(xué)改性法、等離子體法等方法。其中，化學(xué)改性法是通過化學(xué)鍵固定活性因子，這種方法比物理包被法可靠，但過程較為復(fù)雜。共價(jià)固定法是化學(xué)改性法中的一種類型，其以雙官能交聯(lián)劑(如硅烷偶聯(lián)劑)為中介，交聯(lián)劑的一端通過硅醚鍵連接至材料表面，另一端結(jié)合活性因子。

目前利用硅烷偶聯(lián)劑將氨基酸結(jié)合在A-W GC表面的研究少見于文獻(xiàn)資料。本研究是通過制備一種含酰胺基的硅烷偶聯(lián)劑，利用其與無機(jī)材料之間的化學(xué)反應(yīng)使氨基酸固定在材料上；考察材料的改性效果，探究氨基酸的附載對(duì)材料表面上細(xì)胞黏附及生長(zhǎng)的影響，為今后的多肽和蛋白質(zhì)對(duì)材料表面細(xì)胞黏附及生長(zhǎng)影響的研究奠定一定基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

N-β-(氨乙基)-γ-氨丙基三甲氧基硅烷(KH-792)具有可水解基團(tuán)Si-OCH3，水解時(shí)轉(zhuǎn)化成Si-OH，可與被處理的無機(jī)材料表面的Si-OH發(fā)生縮合脫水反應(yīng)形成Si-O-Si鍵。另一方面，KH-792與氨基酸發(fā)生氨羧縮合反應(yīng)形成酰胺基。即通過KH-792的雙官能團(tuán)，將氨基酸接枝至A-W GC表面。

1.1 硅烷偶聯(lián)劑的制備

氨基與羧基縮合脫水生成酰胺的反應(yīng)是可逆反應(yīng)，加入縮合劑除去反應(yīng)生成的水可加快反應(yīng)速度且提高產(chǎn)率，實(shí)驗(yàn)用N,N-二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)作為縮合劑進(jìn)行反應(yīng)。

按照一定的物質(zhì)的量比分別稱取KH-792，谷氨酸和DCC。首先將前兩者加入三頸瓶中，適量的四氫呋喃作為溶劑，磁力攪拌。將三頸瓶置于冰鹽浴中，溫度降至0℃時(shí)加入DCC，反應(yīng)20 h后，減壓過濾，除去沉淀，溶液轉(zhuǎn)至蒸餾瓶中，在0.03 MPa下減壓蒸餾，獲得粗產(chǎn)物。用二氯甲烷和四氫呋喃溶解粗產(chǎn)物，石油醚重結(jié)晶得產(chǎn)品。

1.2 A-W GC的制備

本研究中硅源為正硅酸乙酯(TEOS)，磷源為磷酸三乙酯(TEP)，采用溶膠-凝膠法和煅燒法制備AW GC，制備流程如圖1所示[7-8]。

1.3 表面改性實(shí)驗(yàn)

取適量乙醇-水(物質(zhì)的量比9∶1)溶液，磁力攪拌，加入含酰胺基的硅烷偶聯(lián)劑，水解5 min，再加入A-W GC粉末，30 min后移入烘箱，80℃烘干，取出并用蒸餾水洗至中性，相同溫度烘干24 h。干燥后的粉末每樣稱取0.3 g，20 kN壓力下壓制成直徑為12 mm的圓片，細(xì)胞實(shí)驗(yàn)待用。

1.4 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

1.4.1 MTT實(shí)驗(yàn)

將第五代人骨肉瘤細(xì)胞MG63置于96孔板中，每孔10 000個(gè)。加入上述材料樣品，細(xì)胞培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)1 d，3 d，5 d。孵化結(jié)束前5 h，每孔中加入10μL噻唑藍(lán)(MTT)溶液，37℃培養(yǎng)4 h。移除培養(yǎng)基，所有孔中各加入100μL二甲亞砜(DMSO)。孵化箱中培養(yǎng)5 min，消除氣泡。在490 nm處測(cè)試溶液吸光度。

1.4.2 材料表面細(xì)胞固定

將材料樣品放入24孔板中，加入1 mL含血清的培養(yǎng)基(DMEM)，在細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育過夜。對(duì)MG63細(xì)胞進(jìn)行消化，加入培養(yǎng)液制成細(xì)胞懸液，采用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)法進(jìn)行計(jì)數(shù)，將其稀釋到20 000 mL-1。將上述材料的DMEM吸掉，加入稀釋的MG63細(xì)胞懸液900μL，細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d，每24 h更換一次培養(yǎng)液。取培養(yǎng)3 d的材料/細(xì)胞復(fù)合物，PBS洗3次后，用2．5%戊二醛在4℃下固定過夜，30%～100%的乙醇梯度脫水，乙酸異戊酯置換，CO2超臨界干燥，表面噴金，SEM觀察。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理結(jié)果使用(Means±SD)表示，分析的結(jié)果進(jìn)行了 Bonferroni方法檢測(cè)，p＜0．05具有統(tǒng)計(jì)意義。

2 結(jié)果與討論

2.1 A-W GC的晶相結(jié)構(gòu)

根據(jù)文獻(xiàn)[8]，從XRD圖(圖2)中可看出，在1 200℃燒成的A-W GC中，磷灰石和硅灰石的衍射峰出現(xiàn)，且較尖銳，伴隨著有二氧化硅和鎂黃長(zhǎng)石生成。

2.1 谷氨酸與KH-792的反應(yīng)

谷氨酸在有機(jī)溶劑中溶解度很小，而KH792和DCC易溶，即反應(yīng)屬于液固反應(yīng)。DCC對(duì)應(yīng)產(chǎn)生的1,3-二環(huán)己基脲(DCU)難溶于有機(jī)溶劑，減壓過濾即可分離。根據(jù)氨基和羧基的縮合反應(yīng)原理，谷氨酸和KH792的物質(zhì)的量比為1∶2，調(diào)整DCC的用量，通過條件實(shí)驗(yàn)及結(jié)合紅外光譜分析，確認(rèn)當(dāng)DCC與谷氨酸用量物質(zhì)的量比為0．9∶1時(shí)，能獲得含酰胺基的硅烷偶聯(lián)劑，如圖3所示。

由圖3知，在2 930 cm-1的峰為-CH2的C-H振動(dòng)峰，3 260 cm-1附近的峰為-NH的伸縮振動(dòng)峰，同時(shí)在1 630 cm-1附近出現(xiàn)C=O的較強(qiáng)而尖銳的峰，在1 400 cm-1附近出現(xiàn)-CN和-NH的混合峰，強(qiáng)度較弱，故確認(rèn)產(chǎn)物中有酰胺基生成。譜圖中未出現(xiàn)DCC在2 120 cm-1的特征吸收峰，也未出現(xiàn)DCU在3 327 cm-1的一個(gè)強(qiáng)而窄吸收峰，即產(chǎn)物中幾乎沒有DCC和DCU殘留。

2.2 硅烷偶聯(lián)劑對(duì)A-W GC表面改性

采用合成的硅烷偶聯(lián)劑對(duì)A-W GC進(jìn)行表面改性，其用量分別為A-W GC質(zhì)量的8%和10%，改性前后的紅外光譜圖如圖 4所示，(a)，(b)，(c)分別代表A-W GC，8wt%硅烷偶聯(lián)劑改性AW-GC，10wt%硅烷偶聯(lián)劑改性AW-GC的紅外光譜。

圖中，表面改性后的A-W GC在2 930 cm-1附近出現(xiàn)-CH2的 C-H 振動(dòng)峰，1 650 cm-1，1 458 cm-1出現(xiàn)酰胺的特征峰；Si-O和Si-O-Si在1 041 cm-1的特征峰變寬且紅移至 1 033 cm-1附近，941 cm-1的特征峰消失，可能是硅烷偶聯(lián)劑與材料表面形成R-Si-O-Si，與材料本身的Si-O-Si振動(dòng)吸收帶重合所致，即硅烷偶聯(lián)劑對(duì)A-W GC進(jìn)行了表面修飾[9]。后續(xù)實(shí)驗(yàn)中硅烷偶聯(lián)劑用量均為A-W GC質(zhì)量的8wt%。

將表面改性后的A-W GC進(jìn)行XPS分析。A-W GC為CaO-MgO-SiO2-P2O5-CaF2系統(tǒng)。從XPS圖譜分析(圖5)可知，改性后的A-W GC材料表面出現(xiàn)了氮元素和碳元素，但未出現(xiàn)磷元素，鎂元素和氟元素。對(duì)其中的氮元素和氧元素的峰進(jìn)行擬合處理，如圖6(a)和 5(b)。

從圖6(a)中可推出，氮元素主要是以-NH基團(tuán)(399.13 eV)和-NH2基團(tuán)(400.00 eV)形式存在，即合成的硅烷偶聯(lián)劑中含酰胺基團(tuán)和少量未反應(yīng)的KH-792中的伯胺基存在。圖6(b)中，530.4 eV處為-CH(NH2)COOH特征峰，529.40 eV處為Ca-O特征峰，532.4 eV處為Si-O的特征峰，531.5 eV處為-C(O)NH2特征峰。由此可知，A-W GC的表面被合成硅烷偶聯(lián)劑所覆蓋且兩者已結(jié)合[10]。

2.3 表面改性后材料的體外細(xì)胞相容性實(shí)驗(yàn)

MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖7所示。從圖中可知，細(xì)胞數(shù)量隨時(shí)間增長(zhǎng)而迅速增加。相對(duì)于純的A-W GC和采用KH-792表面改性的A-W GC(硅烷偶聯(lián)劑用量為8wt%)，使用合成硅烷偶聯(lián)劑改性后的A-W GC與MG63細(xì)胞復(fù)合培養(yǎng)，更有利于細(xì)胞MG63在材料表面的粘附和增殖。且通過Bonferroni方法進(jìn)行檢驗(yàn)，結(jié)果顯示表面改性后A-W GC實(shí)驗(yàn)組與未改性的A-WGC對(duì)照之間有顯著差異(p＜0.05)，可以得知，改性后A-WGC材料對(duì)MG63細(xì)胞的生長(zhǎng)具有良好的促進(jìn)作用。

將改性后的A-W GC與MG63細(xì)胞復(fù)合培養(yǎng)3 d，其掃描電鏡結(jié)果如圖8所示。從圖8可知，細(xì)胞牢固地粘附于改性A-W GC較平整表面上，呈多邊形及梭形，細(xì)胞充分鋪展生長(zhǎng)，向四周伸出偽足與較粗糙的A-WGC表面顆粒相連，分泌的細(xì)胞外基質(zhì)包繞于細(xì)胞周圍。說明含酰胺基的硅烷偶聯(lián)劑改性后的A-W GC具有良好的細(xì)胞相容性。

據(jù)文獻(xiàn)[11-15]報(bào)道，從材料的表面電荷分析，哺乳動(dòng)物細(xì)胞膜表面荷負(fù)電，荷正電的材料表面與荷負(fù)電的細(xì)胞由于靜電吸附而利于細(xì)胞黏附，荷負(fù)電的材料表面與荷負(fù)電的細(xì)胞由于靜電排斥，不利于細(xì)胞黏附。本研究通過固定含有豐富正電荷基團(tuán)的谷氨酸在材料表面，提高了材料的表面電荷濃度，增加了黏附細(xì)胞的數(shù)量，也增強(qiáng)了細(xì)胞的黏附力。其次，材料表面的化學(xué)基團(tuán)也是影響細(xì)胞黏附生長(zhǎng)的重要因素，羧基、磺酸基、氨基、亞氨基及酰胺基等基團(tuán)有利于細(xì)胞的黏附。含氮基團(tuán)不僅能使材料表面帶一定的正電荷，調(diào)節(jié)其親水/疏水平衡，也可與蛋白質(zhì)肽鏈發(fā)生官能團(tuán)間的相互作用，促進(jìn)細(xì)胞黏附。通過表面改性在A-W GC的表面引入了上述基團(tuán)，起到了一定作用。

3 結(jié) 論

(1)利用氨基和羧基的縮合反應(yīng)制備出了一種含酰胺基的硅烷偶聯(lián)劑，應(yīng)用于A-WGC的表面改性；

(2)表面改性后的A-W GC其表面電荷及表面基團(tuán)利于細(xì)胞在材料表面的黏附和增殖，提高了AW GC的細(xì)胞相容性，達(dá)到了改性修飾的目的；

進(jìn)一步研究工作設(shè)想：將進(jìn)行不同氨基酸固接在A-W GC上進(jìn)行動(dòng)物體內(nèi)植入試驗(yàn)研究；研究二肽、多肽或蛋白質(zhì)在A-W GC表面上的結(jié)合及對(duì)材料的生物相容性影響。

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