宋玉民 王 莉 姚小強(qiáng)

(西北師范大學(xué)化工學(xué)院，蘭州 730070)

隨著我國社會(huì)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展和控制人口過快增長政策的多年實(shí)施，目前我國社會(huì)開始進(jìn)入老齡化階段，而腦血栓是老年人的一種常見疾病。故對具有抗凝血藥物的研究早已是藥物學(xué)家研究的重點(diǎn)。具抗凝血作用的金屬配合物的合成和性質(zhì)研究亦成為化學(xué)家關(guān)注的研究課題。前期本課題組研究了一些稀土華法靈配合物、稀土水楊酸配合物、稀土華法靈、水楊酸三元配合物和稀土半胱氨酸、枸櫞酸鈉三元配合物、稀土納米氧化物肝素雜化材料的抗凝血功效[1-3]。研究表明,配合物的抗凝血效果均比配體好；二元配合物的抗凝血效果比三元配合物的抗凝血效果好；釹配合物在同類配合物中的抗凝血作用時(shí)間最長。人血清白蛋白是血漿中含量較高的一種蛋白質(zhì)，也是形成血栓的成分之一。配合物的抗凝血作用是否通過改變HSA的構(gòu)象來實(shí)現(xiàn)，而不同構(gòu)象的HSA在血液中的溶解、沉降性能是否不同，導(dǎo)致了血栓形成的容易與否，為此本課題組曾對華發(fā)靈過渡金屬配合物、水楊酸過渡金屬配合物、華發(fā)靈水楊酸過渡金屬三元配合物與HSA之間的作用進(jìn)行過研究，配合物的存在明顯改變?nèi)搜灏椎鞍椎臉?gòu)象[4-6]。為進(jìn)一步探討配合物改變?nèi)搜灏椎鞍讟?gòu)象的原因，本課題組對形成配合物的中心原子(稀土離子)和配體華法林離子(華法林鈉)及水楊酸分子與HSA分子之間的作用進(jìn)行了研究[7-9]，結(jié)果表明稀土離子的存在對HSA的二級結(jié)構(gòu)幾乎沒有影響，華法林離子(華法林鈉)和水楊酸分子的存在可引起HSA二級結(jié)構(gòu)的變化，華法林離子(華法林鈉)與HSA之間的主要作用力是氫鍵和范德華力，水楊酸與HSA之間的主要作用力是疏水作用力。為進(jìn)一步了解釹配合物在同類配合物中的抗凝血作用最好的原因，本文報(bào)道了對華法靈釹(NdL3·2H2O，L=華法靈離子)、水楊酸釹(NdL′3·2H2O，L′=水楊酸離子)、華法靈水楊酸釹(NdL2L′·2H2O)三種配合物(結(jié)構(gòu)如圖1所示)與HSA相互作用的研究。結(jié)果表明：3種配合物均對HSA的熒光產(chǎn)生猝滅作用，華法靈釹和華法靈水楊酸釹配合物對于HSA的猝滅效應(yīng)屬于兩者之間生成了不發(fā)熒光的復(fù)合物而導(dǎo)致靜態(tài)猝滅，而水楊酸釹是動(dòng)態(tài)猝滅與靜態(tài)猝滅兩種效應(yīng)導(dǎo)致的猝滅。并確定了它們的結(jié)合力類型：華法靈釹與HSA之間主要作用力是靜電作用力；水楊酸釹與HSA之間主要作用力為典型的疏水作用力；華法靈水楊酸釹與HSA之間為氫鍵和范德華力。計(jì)算了配合物與HSA的結(jié)合常數(shù)K和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n。并且發(fā)現(xiàn)配合物的存在可引起HSA的構(gòu)象發(fā)生變化，并對HSA在不同濃度的配合物存在時(shí)構(gòu)象發(fā)生變化的原因進(jìn)行了討論。提供了對合成抗凝血效果好、毒性低、水溶性好的藥物有參考意義的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

LS-55熒光分光光度計(jì)(美國PE公司)；Agilent-8453紫外分光光度計(jì) (美國Agilent公司)；J-810圓二色譜儀(日本Jasco公司)；TB-85型恒溫器(日本島津公司)；pHS-25型酸度計(jì)(上海第二分析儀器廠)。

人血清白蛋白為國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品；華法靈釹、水楊酸釹、華法靈水楊酸釹配合物(自制)[1-2]；實(shí)驗(yàn)用水為去離子三次蒸餾水；配制10 mmol·L-1Tris-HCl緩沖溶液，pH=7.37(內(nèi)含 50 mmol·L-1NaCl的溶液維持離子強(qiáng)度)；其余試劑均為分析純。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1．2．1 配合物與HSA作用的熒光光譜

實(shí)驗(yàn)所需的HSA溶液用Tris-HCl緩沖溶液配制(CHSA=10 μmol·L-1)，華法靈釹、水楊酸釹與華法靈水楊酸釹配合物用2次蒸餾水溶解(CQ=10μmol·L-1)，移取 2 mL 10 μmol·L-1的 HSA 溶液于 1 cm 石英比色池中，用微量進(jìn)樣器分別加入不同體積的配合物，分別在20℃和30℃下反應(yīng)5 min后，以λex=282 nm為激發(fā)波長，記錄300～500 nm波長范圍的熒光光譜。并且測定Δλ=15 nm和Δλ=60 nm時(shí)的同步熒光光譜。

1．2．2 配合物與HSA作用的紫外吸收光譜

向加有 2．5 mL 的 50 μmol·L-1HSA 溶液的 1 cm石英吸收池中滴加不同體積的相應(yīng)配合物 (CQ=10 μmol·L-1)溶液，以 Tris-HCl緩沖溶液為參比，掃描紫外吸收光譜。

1．2．3 配合物與HSA作用的圓二色譜(CD)

室溫下，在一系列10 mL比色管中，加入2．5 mL 的 HSA(CHSA=0．10 μmol·L-1)溶液，然后依次加入不同體積的3種配合物溶液，定容后充分震蕩搖勻測定3種配合物與HSA作用的圓二色譜；以相應(yīng)的Tris-HCl緩沖溶液為參比溶液，樣品池為1 cm石英吸收池。

2 結(jié)果與討論

2.1 熒光光譜

圖2 A、B、C分別為華法靈釹配合物、水楊酸釹配合物和華法靈水楊酸釹配合物對HSA溶液熒光影響光譜圖。以激發(fā)波長λex=282 nm分別激發(fā)HSA溶液和配合物溶液，HSA在λem=348 nm附近有很強(qiáng)的熒光發(fā)射峰，而華法靈釹、水楊酸釹與華法靈水楊酸釹3種配合物在該波長附近沒有熒光發(fā)射峰。

固定HSA的濃度，依次加入相應(yīng)的配合物溶液，隨著配合物濃度的增加，HSA在λem=348 nm附近的熒光發(fā)射峰強(qiáng)度有規(guī)律地減弱，并且可以看到圖2A中發(fā)射峰位置有略微的紅移(從348 nm移至354 nm)，HSA在348 nm附近的發(fā)射峰是色氨酸殘基所產(chǎn)生的，而色氨酸殘基的最大發(fā)射波長與它所處的環(huán)境有關(guān)，發(fā)射波長紅移表明HSA中的色氨酸殘基周圍的疏水性有所降低[10-11]。圖2B中的發(fā)射峰位置有略微藍(lán)移(從348 nm移至343 nm)，說明水楊酸釹與人血清蛋白之間通過一定的作用形成了復(fù)合物[10],發(fā)射波長藍(lán)移這表明HSA的構(gòu)象發(fā)生了變化，說明色氨酸殘基周圍的疏水性有所增加[10-11]。華法靈水楊酸釹配合物僅使HAS溶液的熒光強(qiáng)度有所降低。

2.2 熒光猝滅方式

熒光猝滅過程通常分為動(dòng)態(tài)猝滅和靜態(tài)猝滅兩類[12-13]。動(dòng)態(tài)猝滅主要是依賴于分子的擴(kuò)散，溫度越高，擴(kuò)散系數(shù)越大，猝滅常數(shù)的改變與溫度成正比。而靜態(tài)猝滅，溫度升高，基態(tài)配合物的穩(wěn)定性越差，形成常數(shù)越小[14]。動(dòng)態(tài)猝滅是猝滅劑和熒光物質(zhì)的激發(fā)態(tài)分子之間的相互作用過程。其作用過程遵循Stern-Volmer方程：

其中F0為未加入猝滅劑時(shí)的熒光強(qiáng)度；F為加入猝滅劑后的熒光強(qiáng)度；Kq(L·mol-1·s-1)為雙分子猝滅過程的速率常數(shù)；Kqτ0=Ksv(L·mol-1) 稱為 Stern-Volmer猝滅常數(shù)，CQ為猝滅劑的濃度；τ0為沒有猝滅劑存在時(shí)熒光分子的平均壽命，生物大分子的平均壽命約為10-8s[15]；靜態(tài)猝滅是猝滅劑和熒光物質(zhì)分子相互作用生成不發(fā)光的基態(tài)化合物，從而導(dǎo)致熒光物質(zhì)熒光強(qiáng)度降低的過程。其熒光強(qiáng)度與猝滅劑濃度之間的關(guān)系與公式(1)是相同的，但其常數(shù)的物理意義是基態(tài)的形成常數(shù)[16]。

根據(jù)(1)式，以F0/F-1對所加入的配合物濃度CQ作圖，得到人血清白蛋白熒光的Stern-Volmer猝滅曲線。配合物HSA體系在不同溫度下的Stern-Volmer曲線都近似為直線，說明配合物對HSA的熒光猝滅主要存在一種方式，動(dòng)態(tài)猝滅或靜態(tài)猝滅[17]。由(1)式求得猝滅速率常數(shù)見表1，各類猝滅劑對生物大分子的最大動(dòng)態(tài)猝滅常數(shù)為2.0×1010L·mol-1·s-1[18]，然而反應(yīng)中雙分子猝滅常數(shù)Kq遠(yuǎn)大于最大動(dòng)態(tài)猝滅常數(shù)，且隨著溫度的升高，Kq值變小，該3種配合物對HSA的熒光猝滅過程不是動(dòng)態(tài)猝滅而是配合物和HSA之間生成了不發(fā)熒光的復(fù)合物而導(dǎo)致的靜態(tài)猝滅[19]。

表1 配合物-HSA在不同溫度的Stern-Volmer常數(shù)Table 1 Stern-Volmer quenching constant of K sv at different temperature

2.3 用靜態(tài)猝滅法分析配合物與HSA相互的作用

在靜態(tài)猝滅過程中，熒光物質(zhì)與猝滅劑分子間的結(jié)合常數(shù)可根據(jù)熒光強(qiáng)度與猝滅劑濃度的關(guān)系求出。設(shè)蛋白質(zhì)大分子有n個(gè)相同并且相互獨(dú)立的結(jié)合位置。則有下式求出[20]：

其中F0為未加入猝滅劑時(shí)的熒光強(qiáng)度；F為加入猝滅劑后的熒光強(qiáng)度；K為靜態(tài)猝滅常數(shù)，CQ為配合物的濃度。

相關(guān)數(shù)據(jù)代入式(2)，得到lg(F0/F-1)與lg CQ的關(guān)系圖，由圖求出在不同溫度下的NdL3·2H2O，NdL′3·2H2O 和 NdL2L′·2H2O 與 HSA 的結(jié)合常數(shù) K以及結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n(見表2)。從表2中可以看出：NdL3·2H2O，NdL′3·2H2O 和 NdL2L′·2H2O 的結(jié)合常數(shù)K均較小，較大的值也僅在1.0×102L·mol-1，表明配合物與HSA之間的結(jié)合力較弱，配合物與HSA的的結(jié)合常數(shù)隨溫度的升高而減小，進(jìn)一步說明了這幾種配合物對HSA熒光猝滅為靜態(tài)猝滅過程。然而水楊酸釹(NdL′3·2H2O)的結(jié)合常數(shù)隨溫度的升高而增大，達(dá)到了 8.16×102L·mol-1，表明水楊酸釹配合物對HSA熒光猝滅以靜態(tài)為主也含有一定的動(dòng)態(tài)猝滅。

2.4 配合物與HSA之間的作用力類型

有機(jī)小分子和蛋白質(zhì)等生物大分子之間的結(jié)合力主要有氫鍵、范德華力、靜電引力、疏水作用力等。由反應(yīng)前后熱力學(xué)參數(shù)焓變?chǔ)和熵變?chǔ)的相對變化，可以判斷小分子與蛋白質(zhì)分子鏈之間的主要作用力類型[21]。假設(shè)在測定的溫度變化范圍內(nèi)焓變的變化可以忽略，則焓變?chǔ)和熵變?chǔ)以及ΔG可以通過以下的熱力學(xué)方程式求得(見表3)：

表3 熱力學(xué)參數(shù)Table 3 Thermodynamic parameters

Mohammed等[22]根據(jù)大量的實(shí)驗(yàn)結(jié)果總結(jié)出判斷生物大分子與小分子結(jié)合力性質(zhì)的熱力學(xué)規(guī)律，即：ΔS＞0可能是疏水和靜電作用力：ΔS＜0可能為氫鍵和范德華力；ΔH＞0，ΔS＞0 為典型的疏水作用力；ΔH≈0或較小，ΔS＞0 為靜電作用力；ΔH＜0，ΔS＜0為氫鍵和范德華力。從表3數(shù)據(jù)中可以看出NdL3·2H2O-HSA 體系中 ΔH＜0，ΔS＞0，說明華法靈釹與HSA之間主要作用力是靜電作用力；NdL′3·2H2O-HSA 體系中 ΔH＞0，ΔS＞0， 表明水楊酸釹與HSA之間主要作用力為典型的疏水作用力；NdL2L′·2H2O-HSA 體系中 ΔH＜0，ΔS＜0， 表明華法靈水楊酸釹與HAS之間為氫鍵和范德華力。3種配合物與HSA之間作用力的不同，與3種配合物的中心釹バ離子的有效核電荷的高低有關(guān)。因配位基團(tuán)中的羧酸根所連接的基團(tuán)不同，導(dǎo)致羧酸根供電子能力不同，直接影響到了中心離子的有效核電荷的高低。配合物 NdL3·2H2O和 NdL2L′·2H2O與HSA反應(yīng)的ΔH＜0，為放熱反應(yīng)，升高溫度不利于反應(yīng)正向進(jìn)行，而NdL′3·2H2O與HSA反應(yīng)的ΔH＞0，為吸熱反應(yīng)，升高溫度利于反應(yīng)的正向進(jìn)行，這與配合物的靜態(tài)猝滅常數(shù)K值隨溫度的變化曲線相一致。

2.5 同步熒光光譜

固定激發(fā)波長和發(fā)射波長的間距Δλ，同步掃描激發(fā)和發(fā)射單色器可以得到同步熒光光譜，因其具有簡化光譜、窄化譜帶和減少光譜重疊等優(yōu)點(diǎn)，而常被用于研究小分子對蛋白質(zhì)構(gòu)象的影響，進(jìn)而探討蛋白質(zhì)構(gòu)象的變化[17]。蛋白質(zhì)的熒光主要來自于色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸所產(chǎn)生的熒光，它們的熒光強(qiáng)度之比一般為 100∶9∶0．5。 由于苯丙氨酸的熒光強(qiáng)度太弱，所以一般重點(diǎn)考察構(gòu)象發(fā)生變化的是色氨酸還是酪氨酸。在Δλ=15 nm與Δλ=60 nm時(shí)，HSA的同步熒光分別顯示酪氨酸殘基和色氨酸殘基的特征信息[23]。

圖3為NdL′3·2H2O與HSA相互作用的同步熒光光譜。室溫20℃下，固定HSA的濃度，逐漸增加配合物的濃度，記錄Δλ=15 nm與Δλ=60 nm時(shí)的同步熒光光譜。發(fā)現(xiàn)酪氨酸殘基的最大發(fā)射波長稍有紅移(從280 nm移至286 nm)，而色氨酸殘基的最大發(fā)射波長藍(lán)移(從280 nm移至276 nm)。表明配合物的加入使HSA的構(gòu)象發(fā)生變化，酪氨酸殘基所處環(huán)境的疏水性增加，色氨酸殘基所處環(huán)境的疏水性降低。配合物分子的結(jié)合部位可能處于HSA亞結(jié)構(gòu)域中圓筒狀的疏水腔內(nèi)，導(dǎo)致HSA內(nèi)部的疏水結(jié)構(gòu)有一定程度的瓦解。NdL3·2H2O和NdL2L′·2H2O與HSA相互作用的同步熒光光譜與NdL′3·2H2O與HSA相互作用的同步熒光光譜類似。

2.6 紫外光譜

華法靈釹、水楊酸釹和華法靈水楊酸釹在260～300 nm范圍內(nèi)無吸收。圖4為NdL2L′·2H2O配合物對HSA的紫外紫外吸收光譜的影響圖。隨著配合物的加入，HSA在278 nm處的吸收強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)，并且峰位略微紅移3～4 nm。

HSA在278 nm處的吸收峰是其肽鏈上的酪氨酸和色氨酸的苯雜環(huán)π-π*躍遷引起的，吸收強(qiáng)度隨著配合物濃度的增加而加強(qiáng)，說明以上3種配合物與HSA發(fā)生了作用，從而誘導(dǎo)HSA分子鏈發(fā)生了類似降低pH值所出現(xiàn)的蛋白質(zhì)肽鏈伸展現(xiàn)象[24]以至被包含在HSA內(nèi)部的色氨酸和酪氨酸殘基的芳雜環(huán)疏水基團(tuán)裸露出來，使吸收峰的強(qiáng)度增加，與此同時(shí)疏水基團(tuán)之間的疏水作用減弱，由于HSA與加入的配合物生成了新的共軛體系，增加了新的π-π*躍遷，π-π*躍遷能量增大，使得吸收峰發(fā)生了略微的紅移。NdL3·2H2O 和 NdL′3·2H2O 與 HSA 相互作用的紫外光譜與NdL2L′·2H2O與HSA相互作用的紫外光譜類似。

2.7 HSA的構(gòu)象變化

蛋白質(zhì)的各種二級結(jié)構(gòu)(α-螺旋、β-折疊、轉(zhuǎn)角、無規(guī)卷曲)在遠(yuǎn)紫外圓二色譜(178～250 nm)區(qū)域存在特征峰[25]。如無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)的特征峰為195 nm左右的1個(gè)負(fù)強(qiáng)峰(負(fù)科頓效應(yīng)所對應(yīng))；而β-折疊的特征峰為217 nm處的1個(gè)負(fù)寬峰及198 nm處的1個(gè)正強(qiáng)峰(正科頓效應(yīng)所對應(yīng))；對于α-螺旋則對應(yīng)于 192 nm(正)、209 nm(負(fù))以及 222 nm(負(fù))3 個(gè)峰位置[26-27]。

由于HSA是具有光學(xué)活性的物質(zhì)，因此通過測量它的CD圖譜，幫助我們了解它的構(gòu)象,當(dāng)加入配合物之后，通過觀察其CD圖譜的變化來進(jìn)一步了解其結(jié)構(gòu)的變化。

圖5所示，隨著配合物濃度的增加，HSA分子典型的二級結(jié)構(gòu)α-螺旋在209 nm和222 nm處的負(fù)峰略微向低波數(shù)方向移動(dòng)，并且相應(yīng)的振幅也顯著地減弱。表明配合物與HSA分子發(fā)生了相互作用，從而使得HSA肽鏈伸展，影響了HSA的二級結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致了α-螺旋結(jié)構(gòu)減少[28]。這個(gè)結(jié)果與配合物存在時(shí)HSA溶液的熒光光譜中的變化相一致。當(dāng)配合物 NdL3·2H2O 濃度增大到 50 nmol·L-1時(shí) (圖5A，d)，208 nm處負(fù)峰振幅繼續(xù)減小，222 nm處負(fù)峰的振幅反而增大，說明此時(shí)部分HSA分子在結(jié)構(gòu)上發(fā)生了一些變化。當(dāng)配合物NdL2L′·2H2O濃度增大到 25 nmol·L-1時(shí)(圖 5C，c)，也出現(xiàn) 208 nm 處負(fù)峰振幅繼續(xù)減小而222 nm處負(fù)峰的振幅增大的現(xiàn)象。通過計(jì)算得到圖5A中的α-螺旋結(jié)構(gòu)由42.86%減少到22.30%；圖5C中的α-螺旋結(jié)構(gòu)由42.86%減少到25.50%[29-30]。

3 結(jié) 論

通過熒光光譜分析得知，有抗凝血作用華法靈釹和華法靈水楊酸釹配合物對于HSA的猝滅效應(yīng)屬于兩者之間生成了不發(fā)熒光的復(fù)合物而導(dǎo)致靜態(tài)猝滅，而水楊酸釹是動(dòng)態(tài)猝滅與靜態(tài)猝滅兩種效應(yīng)導(dǎo)致的猝滅。并確定了它們的結(jié)合力類型，華法靈釹(NdL3·2H2O)與HSA之間主要作用力是靜電作用力；水楊酸釹(NdL′3·2H2O)與 HSA 之間主要作用力為典型的疏水作用力；華法靈水楊酸釹(NdL2L′·2H2O)與HSA之間為氫鍵和范德華力。通過HSA溶液的同步熒光光譜、紫外吸收光譜和圓二色譜的變化可知，配合物的加入，影響了HSA的二級結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致α-螺旋結(jié)構(gòu)減少。具抗凝血作用的NdL3·2H2O；NdL2L′·2H2O 和 NdL′3·2H2O 與 HSA 結(jié)合后，改變了HSA的構(gòu)象，這對于研究血液中由血清白蛋白的構(gòu)象變化而導(dǎo)致的溶解性變化與血栓的形成有著一定的啟示意義。

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